Die Anwendung des hochempfindlichen digitalen ELISA für p24 ermöglicht eine verbesserte Beurteilung von HIV

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 10958 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das Aufkommen der kombinierten antiretroviralen Therapie (cART) hat maßgeblich dazu beigetragen, die Replikation und Übertragung von HIV-1 zu kontrollieren und die damit verbundene Morbidität und Mortalität zu senken. Allerdings ist cART allein nicht in der Lage, HIV-1 zu heilen, da langlebige, latent infizierte Immunzellen vorhanden sind, die bei Unterbrechung von cART erneut eine Plasmavirämie auslösen. Die Bewertung von HIV-Heilungsstrategien unter Verwendung von Ex-vivo-Kulturmethoden zum besseren Verständnis der Vielfalt von reaktiviertem HIV, des Virusauswuchses und der Replikationsdynamik wird durch den Einsatz hochempfindlicher digitaler ELISA auf Basis der Single-Molecule-Array-Technologie (Simoa) verbessert, um die Empfindlichkeit der Endpunkterkennung zu erhöhen . In Virus-Outgrowth-Assays (VOA) wurde gezeigt, dass das exponentielle HIV-1-Auswachsen davon abhängt, dass die anfängliche Virus-Burst-Größe eine kritische Wachstumsschwelle von 5100 HIV-1-RNA-Kopien überschreitet. Hier zeigen wir einen Zusammenhang zwischen ultrasensitiven HIV-1-Gag-p24-Konzentrationen und der HIV-1-RNA-Kopienzahl, der die Virusdynamik unterhalb der exponentiellen Replikationsschwelle charakterisiert. Die Einzelgenomsequenzierung (SGS) ergab das Vorhandensein mehrerer identischer HIV-1-Sequenzen, was auf eine Replikation auf niedrigem Niveau hinweist, die unterhalb der Schwelle des exponentiellen Wachstums zu Beginn einer VOA auftritt. SGS deckte jedoch darüber hinaus verschiedene verwandte HIV-Varianten auf, die mit ultraempfindlichen Methoden nachweisbar waren und kein exponentielles Wachstum feststellen konnten. Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass ein Virusauswuchs, der unterhalb des für die Etablierung eines exponentiellen Wachstums in der Kultur erforderlichen Schwellenwerts erfolgt, die Replikationskompetenz von reaktiviertem HIV nicht ausschließt und der ultraempfindliche Nachweis von HIV-1 p24 eine Methode zum Nachweis bisher nicht quantifizierbarer Varianten darstellen könnte. Diese Daten unterstützen nachdrücklich den Einsatz der Simoa-Plattform in einem mehrstufigen Ansatz zur Messung der latenten Viruslast und der Wirksamkeit therapeutischer Interventionen zur Heilung von HIV-1.

Während die kombinierte antiretrovirale Therapie (cART) die Replikation des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) kontrolliert und das Fortschreiten der Krankheit weitgehend verlangsamt, ist aufgrund des Vorhandenseins langlebiger Virusreservoirs, die zum Wiederaufleben fähig sind, eine lebenslange Einhaltung des verschriebenen cART-Regimes erforderlich wenn die Therapie unterbrochen wird1,2,3,4,5. Dieses Reservoir wird sehr früh in der Infektion gebildet, ist weit über das gesamte Lymphgewebe im Körper verteilt und stellt nach wie vor ein Haupthindernis für die Ausrottung von HIV-1 dar6. Ruhende CD4+-T-Zellen sind ein gut charakterisierter Zelltyp, der nachweislich einen Teil des latenten HIV-Reservoirs enthält. In einer Reihe klinischer Studien werden derzeit die Auswirkungen von Latenzumkehrmitteln und der Anti-HIV-Immunexpansion auf die Clearance dieser Zellen untersucht7,8.

Um die Wirksamkeit von HIV-1-Heilungsstrategien zu bestimmen, ist die genaue Messung der Häufigkeit latent infizierter Zellen von größter Bedeutung. Herkömmliche PCR-basierte Tests bieten im Vergleich zu Ex-vivo-Auswuchsmethoden eine höhere Verarbeitungsgeschwindigkeit und Empfindlichkeit, sind jedoch nicht in der Lage, zwischen kompetenten Reservoirs, die sich in einem Individuum erholen könnten, und solchen, bei denen dies nicht möglich ist, zu unterscheiden9,10,11. Kürzlich haben eine Reihe von Gruppen über Verbesserungen beim Nachweis intakter proviraler Genome mithilfe mehrerer Primer und Sonden gegenüber konservierten Teilen des viralen Genoms berichtet12,13. Es wird jedoch geschätzt, dass 30–40 % der mit dieser Methode amplifizierten Viren möglicherweise immer noch defekt sind, was teilweise auf Sequenzpolymorphismen zurückzuführen ist, die die erfolgreiche Amplifikation des intakten Provirus einschränken13,14,15. Das andere Extrem sind kulturbasierte Methoden wie der quantitative Virus-Outgrowth-Assay (QVOA), der als Goldstandard für den Nachweis replikationskompetenter Viren gilt. Eine Befragung des QVOA ergab jedoch, dass die tatsächliche Größe des latenten Reservoirs unterschätzt wird, da ein Teil der Proviren nach einer einzigen Zellstimulationsrunde nicht induziert bleibt11,16.

In den letzten 15 Jahren wurden auf dem Gebiet der hochempfindlichen Proteindetektion erhebliche Fortschritte erzielt, darunter die Entwicklung einer bahnbrechenden Einzelmolekül-Array-Technologie (Simoa). Diese Form der digitalen Bead-basierten Immunoassay-Plattform ist in der Lage, die Nachweisgrenzen im Vergleich zum herkömmlichen ELISA um das Tausendfache zu verbessern17,18,19,20. In einer Reihe von Studien wurde Simoa zum Nachweis von HIV-1 p24 in femtomolaren Konzentrationen im Plasma von Menschen mit HIV (PLWH) sowie in Studien zur Untersuchung der Ex-vivo-Induktion der Virusexpression bei cART-supprimierten Personen21,22,23,24 eingesetzt. 25. Die Ultrasensitivität von Simoa bietet einen klaren Vorteil bei der Messung geringer Mengen induzierbarer, translatorisch kompetenter Viren. Die hohe Empfindlichkeit erhöht jedoch auch die Wahrscheinlichkeit, dass die tatsächliche Größe des Reservoirs aufgrund der Produktion von viralem Protein durch replikationsinkompetentes Virus überschätzt wird11,26,27. Bemerkenswert ist, dass der digitale ELISA mittlerweile als einer der primären Endpunkte für die Messung der Konzentrationen von Steady-State- oder induzierbaren, translatorisch kompetenten Viren während klinischer Studien zur HIV-Heilung empfohlen wird14.

Kürzlich wurde in einer eleganten theoretischen und experimentellen Arbeit von Hataye et al.28 versucht, die notwendigen Bedingungen zu bestimmen, die die Etablierung oder den Zusammenbruch der zellulären HIV-1-Ausbreitung in Auswuchskulturen vorantreiben. In der Studie erfasste die Gruppe Zeitreihendaten von HIV-1, das aus infizierten Zellen freigesetzt wurde, um den Übergang zum exponentiellen Viruswachstum, einem entscheidenden Merkmal replikationskompetenter Viren, quantitativ zu bestimmen. Interessanterweise stellte die Gruppe fest, dass die Freisetzung von replikationskompetentem HIV nicht immer die Virusetablierung garantiert, selbst wenn eine De-novo-Infektion stattfindet. Nach umfangreichen Tests auf Synergien für die Virusetablierung stellten die Forscher jedoch fest, dass ihr Auswuchssystem die HIV-1-Ausbreitung nach Latenzumkehr in Fällen unterstützte, in denen der anfängliche Virusausbruch 5100 HIV-1-RNA-Kopien überschritt, eine kritische Schwelle, die für die Etablierung eines exponentiellen Wachstums erforderlich ist in der Outgrowth-Kultur. Es wurde festgestellt, dass oberhalb dieses Schwellenwerts im Durchschnitt eine ausreichende Anzahl freigesetzter HIV-1-Viren vorhanden war, um ein synergistisches Wachstum zu unterstützen, während unterhalb dieses Schwellenwerts das Virus typischerweise aussterben würde. Aufgrund dieser Erkenntnisse stellten wir die Hypothese auf, dass die Simoa-Technologie in der Lage sein könnte, HIV-1 unterhalb der kritischen Wachstumsschwelle von 5.100 HIV-1-RNA-Kopien zu erkennen. Um diese Hypothese zu testen, haben wir die QVOA mit digitaler p24-Auslesung und HIV-1-RNA-Quantifizierung gekoppelt, um die Wachstumskinetik extrem niedriger Viruskonzentrationen in Kulturüberständen zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglichte eine verbesserte Charakterisierung der Vielfalt der von Simoa nachgewiesenen reaktivierten Viren und ermöglichte die frühzeitige Erkennung replikationskompetenter Varianten.

Um das Vertrauen in den hochempfindlichen und spezifischen Nachweis von HIV-1 p24 in QVOA-Überständen mithilfe der Quanterix Simoa-Plattform zu stärken, haben wir die Nachweisgrenzen bewertet und angepasst, um die Matrixeffekte zu berücksichtigen, ein wichtiges Thema bei der Bewertung von Ligandenbindungstests29. Um den digitalen ELISA als neuartigen QVOA-Endpunkt zu bewerten, verglichen wir zunächst die Quantifizierung von rekombinantem HIV-1-p24-Protein, HIV-1NL4-3 und HIV-192/BR/014, die in Vollmedien seriell verdünnt wurden, unter Verwendung digitaler und herkömmlicher ELISA-Ansätze. Der ultraempfindliche digitale und der konventionelle ELISA arbeiteten innerhalb der p24-Konzentrationsbereiche, die beiden Methoden gemeinsam sind, und lieferten Antigenkonzentrationen, die signifikant miteinander korrelierten (Abb. 1A), wobei rekombinantes Protein den höchsten Korrelationskoeffizienten lieferte (r = 0,9988, P < 0,0001). Wichtig ist, dass die HIV-1-Kulturisolate HIV-1NL4-3 und HIV-192/BR/014 auch starke Korrelationen zwischen Quantifizierungsmethoden lieferten, was darauf hindeutet, dass der digitale ELISA p24 als Teil infektiöser Virionen effektiv erkennt und quantifiziert. Da jedoch die größte beobachtete Variabilität am unteren Ende des Testbereichs auftrat, war es nicht möglich, Korrelationen bei Konzentrationen unterhalb der unteren Quantifizierungsgrenze (LLOQ) von 3,25 pg/ml p24-Antigen für den herkömmlichen ELISA zu bestimmen, die aus dem generiert wurden Standardkurve30.

Der digitale ELISA bietet eine robuste Methode zum Nachweis von HIV-1 p24. (A) Korrelation von HIV-1 p24, gemessen mit Simoa und konventionellem ELISA (Pearson-Korrelationskoeffizient, r). Für jeden Verdünnungssatz wurden zwei Replikate bewertet, sowohl für Simoa als auch für den konventionellen ELISA. (B) Bewertung der Wiederfindung des angereicherten klinischen Isolats HIV-192/BR/014 in HIV-negativen Proben. HIV-192/BR/014 wurde seriell verdünnt und der Testmatrixeffekt wurde durch Vergleich der von Simoa gemessenen Konzentration mit der erwarteten (RMSE = Root Mean Square Error) bewertet. Für jeden Verdünnungsparameter wurden zwei Wiederholungen bewertet. (C) Häufigkeitsverteilung von HIV-negativen Proben. Die Nachweisgrenze (LOD) für den QVOA-spezifischen digitalen p24-Assay wurde mit 0,0515 pg/ml ermittelt. Zur Berechnung der LOD wurde ein Grubb-Ausreißertest durchgeführt, um zwei signifikante Ausreißer aus insgesamt 226 HIV-negativen Proben (Teilnehmer 6513-R) zu entfernen. Der QVOA-spezifische LOD wurde berechnet, indem drei Standardabweichungen (0,005577 pg/ml) des Mittelwerts zum maximalen p24-Wert (0,03480 pg/ml) addiert wurden, der aus bekannten HIV-negativen Proben erhalten wurde.

Um mit der Bewertung der Leistung der digitalen ELISA p24-Quantifizierung in Gegenwart von Nebenprodukten der Langzeitzellkultur zu beginnen, führten wir Spike- und Recovery-Tests durch, indem wir HIV-192/BR/014 seriell in überschüssigen Überständen verdünnten, die aus Negativkontrollvertiefungen von QVOA gesammelt wurden enthielt allogene Feederzellen, aber keine beteiligten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs). Die erwarteten und gemessenen p24-Konzentrationen zeigten eine signifikante Korrelation mit einem quadratischen Mittelfehler (Root Mean Square Error, RMSE) von 0,1678 und einem R2 von 0,9872 (Abb. 1B). Wichtig ist, dass die beobachteten Werte innerhalb des akzeptablen Bereichs von 0,008 bis 39,5 pg/ml lagen, wie aus dem Analysezertifikat für das Simoa p24-Kit hervorgeht, das in der ersten Bewertungsanalyse verwendet wurde (Simoa HIV p24-Kit, Charge 500621). Dieser Befund lieferte einen starken Beweis für die Empfindlichkeit des digitalen ELISA im Zusammenhang mit der Kulturüberstandsmatrix.

Um eine robuste und QVOA-spezifische Nachweisgrenze (LOD) mithilfe der hochempfindlichen Simoa HIV p24-Messung zu bestimmen, analysierten wir insgesamt 226 Überstände, die während der QVOA an PBMC eines bekannten seronegativen HIV-1-Spenders (Teilnehmer 6513-R) erzeugt wurden. Ein Grubb-Ausreißertest wurde durchgeführt und zwei signifikante Ausreißer wurden gefunden und aus dem Datensatz entfernt. Obwohl der in der Mehrzahl (92,4 %) der Überstände gemessene p24-Wert unter dem vom Hersteller angegebenen LLOQ von 0,012 pg/ml (Abb. 1C) (Simoa HIV p24 Kit, Charge 500802) lag, lieferten 17 Proben aus bekanntermaßen HIV-negativen QVOA-Vertiefungen Ergebnisse p24-Antigenkonzentrationen über der LLOQ des Herstellers, was zu einer Falsch-Positiv-Rate von 7,6 % führt. Um falsch-positive Ergebnisse auszuschließen und die funktionelle Empfindlichkeit des digitalen ELISA angemessen zu erfassen, haben wir einen QVOA-spezifischen LOD von 0,0515 pg/ml ermittelt, indem wir drei Standardabweichungen des durchschnittlichen p24 aus diesem Probensatz zur höchsten Konzentration von p24 addierten, die beim Testen der Überstände gefunden wurde aus bekannten HIV-negativen Kulturbrunnen. Interessanterweise wurde ein ähnlicher Wert in einer aktuellen Studie berichtet, die den Einsatz von digitalem ELISA im Zusammenhang mit QVOA31 untersuchte. Die Autoren legten den LLOQ des Assays fest und legten fest, dass Konzentrationen, bei denen insgesamt weniger als 20 % vorhanden waren, etwa 50 fg/ml oder 0,050 pg/ml betragen sollten. Da wir in unserer Studie jedoch keine Analyse des Gesamtfehlers des Assays durchgeführt haben32,33, bezeichnen wir diesen Parameter als LOD. Um die Verwendung dieses neuen LOD zu bestätigen und die Korrelation zwischen digitalen und herkömmlichen ELISA-p24-Werten zu bewerten, haben wir Kulturüberstände aus Tests identifiziert und erhalten, die für 5 unabhängige HIV-positive Teilnehmer durchgeführt wurden (1126-R, 2026-R, 2147-R, 2208- R und 3068-R), bewertet durch dreifache QVOA, wie bereits berichtet34. Ähnlich wie bei unseren In-vitro-Ergebnissen beobachteten wir eine signifikante Korrelation zwischen den durch digitalen und konventionellen ELISA erzeugten p24-Konzentrationen bei der Beurteilung der HIV-Reaktivierung aus Ex-vivo-Proben, die von QVOA getestet wurden (Abb. 2A). Darüber hinaus diente die Bewertung der Negativkontrollen für diese Tests auch zur Validierung unseres neu eingerichteten LOD für die Simoa-Plattform (Abb. 2B).

Der digitale ELISA liefert höhere Reservoirwerte von HIV-1-infizierten Spendern und weist HIV-1 p24 zu früheren Testzeitpunkten nach. (A) Korrelation von HIV-1-p24-Messungen durch Simoa und konventionellem ELISA (Pearson-Korrelationskoeffizient, r) in einem Satz dreifacher QVOAs, die an 5 HIV-1-infizierten Spendern durchgeführt wurden. (B) Der digitale ELISA erzeugt im Laufe der Testdauer an verschiedenen Tagen deutlich mehr positive Wells, wie durch Chi-Quadrat-Analyse festgestellt wurde. * bedeutet p < 0,05, ** bedeutet p < 0,01 und *** bedeutet p < 0,001. (C) Die Kopplung von Simoa mit QVOA ermöglichte es allen Assays, eine Reservoirmessung zu liefern, während herkömmlicher ELISA in vier Assays keine quantifizierbare Messung lieferte. Reservoirhäufigkeiten und zugehörige 95 %-Konfidenzintervalle (Fehlerbalken) werden für jedes Replikat ab Tag 20 der QVOA-Kultur aufgezeichnet. Signifikant sind Bereiche, in denen sich die Konfidenzintervalle nicht überschneiden. BD unter Erkennung.

Eines unserer Hauptziele bei der Bewertung des ultrasensitiven p24-Nachweises bestand darin, festzustellen, ob Simoa die Identifizierung reaktivierter replikationskompetenter HIV-Proviren verbessern würde. Wir haben die Konzentration von HIV-1 p24 mithilfe konventioneller und digitaler ELISAs an QVOA-Überständen gemessen, die in den Tests an den Tagen 8, 12 und 2034 gesammelt wurden. Aufgrund begrenzter Kulturvolumina aus früheren Studien34 wurden diese Analysen an verfügbaren und zuvor kryokonservierten QVOA-Überständen durchgeführt (A-Wells: 1 × 106 rCD4+ T-Zellen/Well). Im Vergleich zur entsprechenden herkömmlichen ELISA-Analyse führte die Verwendung des digitalen ELISA mit einem Grenzwert von 0,0515 pg/ml (51,5 fg/ml) für die binäre (positive oder negative) QVOA-Well-Bewertung zu deutlich mehr p24-positiven Wells (nach Chi-Quadrat). Analyse) zu jedem getesteten Assay-Zeitpunkt (Abb. 2B). Die Erhöhung des Prozentsatzes der als p24-positiv bewerteten Vertiefungen führt direkt zu einer höheren Häufigkeit von Messungen infektiöser Einheiten pro Million (IUPM) ruhender CD4+-T-Zellen, wie von IUPMStats v1.035 berechnet. Der hochempfindliche digitale ELISA ermöglicht den Nachweis von p24-Konzentrationen im Femtogramm pro Milliliter. Da die Infektiosität von HIV bei solch extrem niedrigen Konzentrationen jedoch weder bestätigt noch widerlegt wurde, haben wir zur Definition „p24-produzierende Zellen pro Million“ ruhender CD4+-T-Zellen verwendet reaktivierte HIV-Reservoirfrequenzen (Abb. 2C) anstelle von IUPM. Durch die Integration einer digitalen ELISA-Anzeige konnten alle Tests eine messbare Häufigkeit des reaktivierten HIV-Reservoirs liefern, während der Standard-ELISA in vier Teilnehmertests keine quantifizierbaren Messungen lieferte (Abb. 2C).

Um die Integrität des durch ultraempfindliche Methoden nachgewiesenen Virus zu untersuchen, verglichen wir die Konzentration des HIV-1-p24-Proteins mit quantifizierten RNA-Genomen in jedem Überstand, die zuvor auch durch konventionellen ELISA bewertet wurden (Abb. 2 und 34). Die Konzentration der HIV-1-RNA-Genome wurde mit dem Aptima HIV-1 Quant Dx Assay (Hologic, PRD-03565)36,37,38 auf dem Panther-System (Hologic, San Diego, CA) quantifiziert. Wie in Abb. 3 gezeigt, zeigten digitale ELISA- und Panther-Analysen, die an QVOA-Überständen der Testtage 8, 12 und 20 durchgeführt wurden, eine gespiegelte HIV-1-Wachstumskinetik oberhalb und unterhalb der Nachweisgrenze des herkömmlichen ELISA. In den 92 analysierten QVOA-Kulturen wurden Fälle beobachtet, in denen die HIV-1-p24- und RNA-Genomkonzentration zunahm, sich stabilisierte und abnahm. Durch die Durchführung einer Korrelationsanalyse interpolierter Daten in Verbindung mit QVOA-spezifischem LOD zeigte sich bei allen fünf Studienteilnehmern eine signifikante positive Korrelation zwischen der Konzentration von HIV-1 p24 und den RNA-Genomen. Wir beobachteten einen Korrelationskoeffizientenbereich von r = 0,4151 (p = 0,0003) für den Teilnehmer 1126-R bis r = 0,7352 (p < 0,0001) für den Teilnehmer 2026-R.

Der hochempfindliche HIV-1-p24- und RNA-Genomnachweis korrelieren stark und zeigen Wachstumskinetiken bei Konzentrationen, die mit herkömmlichem ELISA nicht nachweisbar sind. Überstände, die an den Tagen 8, 12 und 20 der QVOA gesammelt wurden und zuvor veröffentlicht wurden34, wurden mittels Standard-ELISA, digitalem ELISA und HIV-1-RNA von Panther auf das Vorhandensein von HIV-1 p24 analysiert. Die durch digitalen ELISA gemessenen HIV-1-p24-Konzentrationen und die HIV-1-RNA-Konzentrationen in QVOA-Überständen korrelieren direkt (Pearson-Korrelationskoeffizient, r). Die gepunktete rote Linie zeigt die untere Quantifizierungsgrenze für ELISA- (3,25 pg/ml p24-Antigen) und Panther-Tests (30 RNA-Kopien/ml) sowie die Nachweisgrenze für Simoa (0,0515 pg/ml p24-Antigen) an. Die durchgezogene blaue Linie zeigt die Beziehungsäquivalenz von 1 pg HIV-1 p24 zu 2 × 104 HIV-RNA-Kopien an, die als Reifepartikelkorrelation (MPC) bezeichnet wird.

Es wurde zuvor gezeigt, dass in Gegenwart von Proteaseinhibitoren, die die Spaltung von Gag- und Gag-Pol-Proteinvorläufern verhindern, aus HIV-1-infizierten Zellen freigesetzte Viruspartikel nicht infektiös und unreif sind39,40. Eine deutlich höhere Menge an HIV-p24-Gag-Protein bildet den unreifen Viruskern41. Durch Verfolgung der Beziehungsäquivalenz von 1 pg HIV p24 zu 2 × 104 HIV-RNA-Kopien, die gemäß etablierten Stöchiometriemodellen einem vollständig zusammengesetzten Viruspartikel entspricht41, in Abb. 3 als durchgezogene blaue Linie dargestellt und im Folgenden als Korrelation reifer Partikel bezeichnet (MPC) wurde es möglich, die defekten oder unreifen Viruspartikel im Vergleich zu den voll ausgereiften zu identifizieren. Während alle analysierten Proben Abweichungen vom MPC aufwiesen, haben wir auch Proben beobachtet, die mit dem MPC in der Region in der Nähe des QVOA-spezifischen LOD von Simoa übereinstimmten. Interessanterweise enthielten bei Teilnehmer 1126-R eine große Anzahl der analysierten Proben eine höhere Menge an HIV-p24 im Vergleich zu den RNA-Genomen, was auf die Induktion fehlerhafter Proviren mit beibehaltener Fähigkeit zur Produktion von p24 nach Ex-vivo-Stimulation im Zusammenhang mit dem Viruswachstum hinweist Test. Wenig überraschend war der Korrelationskoeffizient für 1126-R der niedrigste unter den fünf analysierten Studienteilnehmern.

Übereinstimmende, proportionale Wachstumskinetiken zwischen HIV-1-p24- und RNA-Genomkonzentrationen im Verlauf einer QVOA lieferten einen geeigneten Datensatz, um empirisch zu testen, ob sich die Häufigkeit von p24-produzierenden Zellen pro Million ruhender CD4+-T-Zellen im Laufe der Zeit zwischen den Testtagen 8 und 12 ändert und 20. Ähnlich wie bei früheren Erkenntnissen31 stellten wir fest, dass der an 12-Tage-Kulturproben durchgeführte digitale ELISA im Vergleich zum herkömmlichen ELISA am Tag den größten durchschnittlichen Anstieg der Häufigkeit p24-produzierender Zellen pro Million (7,01 ± 0,31) ergab 20 der Kulturen (Tabelle 1S) und dass die Aufrechterhaltung der Kulturen über 12 Tage hinaus die Anzahl der positiven Vertiefungen, die mit keiner der ELISA-Methoden identifiziert wurden, für alle fünf Studienteilnehmer des HIV Reservoir Assay Validation and Evaluation Network (RAVEN) signifikant erhöhte. (Chi-Quadrat-Analysen: digitaler ELISA p > 0,0722, konventioneller ELISA p > 0,0893). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der digitale ELISA die Dauer der QVOA-Kultivierung effektiv verkürzt, was zu einer Reduzierung des Aufwands und der Kosten bei der Messung latenter HIV-1-Reservoire führt, was für die HIV-1-Heilungsagenda von großer Bedeutung ist42,43.

Angesichts der Tatsache, dass die HIV-1-RNA-Quantifizierung durch den Aptima HIV-1 Quant Dx Assay (Abb. 3) ein klares Vorhandensein viraler Genome zeigte und neuere Arbeiten ergaben, dass ein viraler Ausbruch von 5100 HIV-RNA-Kopien erforderlich ist, um ein exponentielles Wachstum zu etablieren28, untersuchten wir HIV- 1 p24- und RNA-Genomkonzentrationen und -kinetik im Zusammenhang mit der Größe des Virusausbruchs und dem anschließenden Wachstum. In unseren QVOA-Kulturen, die reaktiviertes HIV-1 von cART-supprimierten Studienteilnehmern enthielten, stellten wir fest, ob exponentielles Wachstum oder dessen Fehlen durch den Allee-Effekt erklärt werden kann, ein biologisches Phänomen, das die Bevölkerungsbildung als Nebenprodukt der Synergie zwischen Individuen charakterisiert28,44 ,45. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Anzahl der p24-Einheiten, die zur Bildung des HIV-Kapsids erforderlich sind, zwischen 1000 und 300041,46 liegt. In dieser Studie gingen wir von 2000 p24-Molekülen pro Virion aus22,47,48. Mit einem Virion, das zwei Kopien von RNA enthält, setzen wir die Achse der HIV-1-p24-Moleküle pro Milliliter auf das 1000-fache der RNA-Genomachse. Darüber hinaus haben wir in Anlehnung an das Stöchiometriemodell41, das darauf hindeutet, dass 1 pg p24-Gag-Protein 104 Viruspartikeln entspricht, eine Simoa-LOD von 0,0515 pg/m berechnet, was 1 × 106 p24-Molekülen/ml entspricht (hellblau gefüllter Bereich in Abb. 4). Schließlich stellten wir nach der Umstellung des Schwellenwerts von insgesamt 5.100 HIV-RNA-Kopien (Wert im Zusammenhang mit 0,1 ml Kulturüberstand)28 auf 51.000 HIV-RNA-Kopien/ml fest, dass dieser Schwellenwert tatsächlich das spätere Viruswachstum in ausgewählten analysierten Proben bedingte (Abb . 4). Diese Beobachtung war besonders deutlich in Fällen, in denen die digitale Anzeige eine HIV-p24-Konzentration ermittelte, die ungefähr dem Schwellenwert entsprach oder darüber lag (Abb. 4: 36-A18 Tag 12, 30-A5 Tag 12 und 42-A2 Tag 12). Interessanterweise haben wir auch eine große Anzahl von Kulturvertiefungen identifiziert, die Viren enthielten, die keine exponentielle Infektion hervorrufen konnten, sondern eher um den vorhergesagten kritischen Wert schwelten oder ganz abnahmen. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass virale Überstände, die durch niedrige p24-Werte gekennzeichnet sind, wie durch einen hochempfindlichen digitalen ELISA nachgewiesen, möglicherweise replikationskompetente Virionen beibehalten, jedoch aufgrund unzureichender Replikationsniveaus nach einer latenten HIV-1-Provirus-Reaktivierung nicht in der Lage sind, eine exponentielle Replikation zu etablieren.

Hochempfindliche Methoden zum Nachweis von HIV-1 p24 und viraler RNA liefern Hinweise auf eine HIV-1-Reaktivierung, die nicht zu einem exponentiellen Wachstum führt. Jedes Panel stellt eine einzigartige Vertiefung eines einzelnen QVOA dar und zeigt die virale Kinetik durch Messungen von entweder HIV-1-p24-Molekülen (rot ausgefüllte Kreise und rote durchgezogene Linien) oder HIV-RNA-Kopien (blau ausgefüllte Quadrate und blaue durchgezogene Linien), die an drei verschiedenen Orten durchgeführt wurden Zeitpunkte während des Tests. HIV-1-p24-Moleküle pro Milliliter-Achse auf das 1000-fache der RNA-Genomachse eingestellt. Die gepunktete Linie stellt den Schwellenwert von 5.100 HIV-RNA-Kopien dar (umgerechnet in 51.000 HIV-RNA-Kopien/ml). Der hellblau gefüllte Bereich stellt den Bereich unterhalb der LOD des digitalen ELISA dar (1 × 106 p24-Moleküle/ml). Der grau ausgefüllte Bereich stellt den Bereich unterhalb der unteren Quantifizierungsgrenze (LLOQ) des Panther Hologic HIV-1-RNA-Systems von 30 HIV-RNA-Kopien/ml dar. Für Probe 45-A1 (markiert mit einer rosa Raute) wurde eine Einzelgenomsequenzierung durchgeführt, um die Virusreplikation zu beurteilen (Abb. 5).

Um die Diversität des induzierten Virus zu charakterisieren, das in Kulturüberständen des digitalen ELISA p24+/konventionellen ELISA p24- gefunden wurde, führten wir eine Einzelgenomsequenzierung (SGS) der viralen RNA aus Vertiefung 45-A1 von QVOA 45 (2147-R) durch, die sich nicht etablieren ließ exponentielle Replikation nach Erkennung als p24+ durch digitales Auslesen (Abb. 4 und 5) sowie auf viraler RNA aus Vertiefungen von QVOA 26 (2147-R), die erfolgreich ein Auswachsen etablierten. Interessant ist, dass sechs von sieben Knoten, die durch SGS-Analyse von P6-PR-RT an sechs Überständen mit konventioneller Replikationskompetenz identifiziert wurden, zwischen 7 und 18 identische Sequenzen enthielten, was möglicherweise auf die Induktion eines replikationskompetenten Provirus in expandierten T-Zellen hindeutet Klone in vivo49,50. Darüber hinaus zeigten ausgewählte Sequenzen in den Vertiefungen das Vorhandensein einzelner Nukleotidunterschiede zu einer Reihe identischer Sequenzen, was wahrscheinlich auf die Anhäufung neuer Mutationen vor dem Hintergrund identischer Sequenzen als Folge eines RT-Fehlers nach der Virusreplikation in der QVOA-Vertiefung hinweist. statt der Induktion verschiedener proviraler Klone. Im Gegensatz dazu zeigte der einzelne Überstand aus Vertiefung 45-A1 (2147-R), der für den p24-Nachweis einen digitalen ELISA erforderte (0,0693 pg/ml HIV-1 p24), sechs Knoten, die aus sieben einzigartigen Sequenzen bestanden, was auf die Reaktivierung eines größeren Pools an Proviren hinweist DNA. In zwei dieser sechs Knoten beobachteten wir vier identische Sequenzen, was möglicherweise auf eine Reaktivierung eines replikationskompetenten Provirus hindeutet, das kein Auswachsen bewirken konnte, obwohl eine Übereinstimmung zwischen einer nahezu vollständigen Sequenz aus QVOA-Wells und zellassoziierter HIV-RNA oder Provirus-DNA möglich wäre für einen stärkeren Fall. Das Vorhandensein eines Knotens, der einzelne Nukleotidunterschiede aufweist, deutet außerdem auf eine geringe Virusreplikation in dieser Vertiefung hin. Trotz Versuchen, eine SGS-Analyse an Überständen der QVOA-Tage 12 und 20 durchzuführen, bei denen die p24-Konzentrationen zwischen 0,0719 und 2,797 pg/ml lagen, wurden nach dem 8. Tag der Kultivierung keine nachweisbaren Einzelgenomsequenzen gefunden, was möglicherweise auf eine RNA-Scherung in der Langzeitkultur hinweist.

Niedrige p24-Konzentrationen, die ultraempfindliche Nachweisansätze erfordern, offenbaren ein vielfältigeres Repertoire an reaktiviertem HIV-1. Jeder Kreis oder jede Raute stellt ein einzelnes, einzigartiges RNA-Genom dar, das durch P6-PR-RT-Einzelgenomsequenzierung80 gefunden wurde, die an QVOA-Kulturüberständen des RAVEN-Teilnehmers 2147-R durchgeführt wurde. Schwarze Dreiecke stellen provirale Sequenzen dar, die in gemischten PBMC des RAVEN-Teilnehmers 2147-R gefunden wurden. Ein Sternchen kennzeichnet Stoppcodons. Die Sequenzen wurden verarbeitet, um 1–2 Nukleotidänderungen sichtbar zu machen.

Angesichts des Aufwands, der Finanzierung und der Proben, die erforderlich sind, um QVOA für die Auswertung klinischer Studien durchzuführen, kann die Bestimmung von HIV-1-Reservoirmessungen unterhalb der assayspezifischen Nachweisgrenzen mit herkömmlichem ELISA nicht schlüssig sein. Die anfängliche Bewertung der HIV-1-Reaktivierung in einer Reservoirmessung für eine > 15-jährige Folgeprobe, die von einem Studienteilnehmer einer klinischen RV130/514-Studie (NCT01013415) mittels konventionellem ELISA entnommen wurde, ergab keine Reservoirmessung, ein digitaler ELISA identifizierte sie jedoch HIV-1 p24 über der LOD in 7 von 16 Überständen (Abb. 1S). Alle durch digitalen ELISA erfassten Messungen zeigten Konzentrationen von HIV-1-p24-Molekülen unterhalb des kritischen Schwellenwerts der Genomkopieäquivalente, die zur Etablierung einer exponentiellen Replikation erforderlich sind, was darauf hindeutet, dass entweder ein unzureichendes Ausmaß der Virusreaktivierung oder ein unzureichendes Ausmaß der Replikation in den Wells vorliegt, was zu einem Fehlstart führt Ex-vivo-exponentielles Wachstum in der Kultur. Letztendlich ergab der QVOA in Verbindung mit dem digitalen ELISA eine Reservoirmessung (0,778 p24-produzierende Zellen pro Million ruhender CD4-T-Zellen mit einem 95-prozentigen Konfidenzintervall von 0,365 bis 1,665), während der herkömmliche ELISA und der integrierte HIV-1-DNA-Assay keine quantifizierbare Aussage lieferten Messung (Abb. 1S).

Mit dem Aufkommen der Simoa-Technologie17,19,20 wurde der digitale p24-ELISA zu einem neuen Endpunkt für Tests zur Messung des HIV-Reservoirs21,23,31. Angesichts der hohen Empfindlichkeit des digitalen ELISA, der Frage nach unspezifischen Hintergrundsignalen und der zahlreichen defekten Proviren bestehen jedoch Bedenken hinsichtlich der Replikationskompetenz des von Simoa erkannten Low-Level-Virus. Hier haben wir die Kinetik und Zusammensetzung von Viruspartikeln beschrieben, die unter den für ex vivo exponentielles Wachstum erforderlichen Schwellenwert fielen und nur mit ultraempfindlichen HIV-1-Nachweismethoden nachweisbar waren. Diese Charakterisierungen, die an Längskulturüberständen durchgeführt wurden, wurden durch Quantifizierung von HIV-1-p24-Molekülen mithilfe von Simoa und RNA-Genomen mithilfe der Panther Aptima-Plattform durchgeführt. Derzeit ist unsere Studie die erste, die den Einsatz der Simoa-Technologie in Kombination mit QVOA, Hochdurchsatz-HIV-1-RNA-Quantifizierung und Einzelgenomsequenzierung einbezieht, um die Natur von p24 in niedrigen Konzentrationen zu untersuchen, das mit ultraempfindlichen Methoden nachgewiesen wird.

Das Finden starker Korrelationen zwischen Viruskomponenten (Abb. 3) und einem Verhältnis von 2000 HIV-1-p24-Molekülen zu 2 Kopien des HIV-1-RNA-Genoms, wie durch die linke und rechte Achse in Abb. 4 dargestellt, skaliert auf 1000 zu 1, kann möglicherweise hilfreich sein schlagen die Produktion von entsprechend zusammengesetzten Viruspartikeln vor, anstatt nicht zusammengesetztes Kapsid, das aus sterbenden Zellen freigesetzt wird. Wie zu erwarten war, beobachteten wir in 92 QVOA-Kulturen, die aus von fünf Menschen mit HIV gespendeten Proben erzeugt wurden, ein breites Spektrum an Replikationskinetiken, darunter exponentielles Wachstum, Fälle, in denen Verhältnisse von p24-Molekülen zu RNA-Genomen auf zusammengesetzte Viruspartikel schließen lassen, und Fälle, in denen Verhältnisse von p24-Molekülen auftraten zum RNA-Genom veranschaulichen defekte oder nicht zusammengesetzte Viruspartikel. Diese letzte Beobachtung steht im Einklang mit früheren Erkenntnissen, die den erheblichen Anteil von Genomen mit Hypermutationen und internen Deletionen11,51,52,53,54,55 zeigen, die noch p24 produzieren könnten. Interessant ist, dass eine kürzlich durchgeführte Studie56 eine große Variabilität zwischen den induzierten Proviren auf der Grundlage molekularer Tests ergab, wohingegen wir in unserer Studie Hinweise auf die Variabilität zwischen und innerhalb der Teilnehmer von induzierbaren, translatorisch kompetenten Proviren vorlegen.

Ähnlich wie andere Gruppen24,31, die die digitale p24-Auslesung erfolgreich eingesetzt haben, um die Größe des latenten HIV-1-Reservoirs abzuschätzen, beobachteten wir eine Reihe von Fällen, in denen HIV-1-negative Proben von QVOA bei der ersten Analyse positiv zu sein schienen. Um dieses Problem zu lösen und einen QVOA-spezifischen LLOQ zu bestimmen, wurde ein modifiziertes Protokoll mit Triton X-100 und Verdünnungspuffer bestehend aus Casein in PBS und FBS vorgeschlagen24. Interessanterweise berichten wir hier über einen vergleichbaren LOD ohne Implementierung von Protokolländerungen, der vielmehr durch eine eingehende Analyse von 226 HIV-1-negativen Proben ermittelt wurde, bei der zuvor veröffentlichte Methoden mit geringfügigen Änderungen zum Einsatz kamen. Dieser Befund legt nahe, dass die Bedingungen des Quanterix-Herstellers für den Nachweis und die Quantifizierung von HIV-1 p24 in einem Viruswachstumstest ausreichend sind. Es scheint, dass die Kultur-Assay-Matrix der primäre Faktor für die LOD-Variabilität ist und weitere Untersuchungen erfordert, wenn eine höhere Empfindlichkeit gewünscht wird.

Wichtig ist, dass unsere Ergebnisse aktuelle Studien von Hataye et al.28 direkt bestätigen, die zeigen, dass der Übergang zu exponentiellem Wachstum, ein entscheidendes Merkmal der Virustauglichkeit für einen Rebound, davon abhängt, dass die Virus-Burst-Größe einen kritischen Schwellenwert von 5100 HIV-RNA-Kopien überschreitet. In unserer Studie liefern wir Belege für einen kritischen Schwellenwert bei der Ex-vivo-Reaktivierung, Kultivierung und dem Wachstum von HIV-1 aus cART-supprimierten Menschen mit HIV. Wichtig ist, dass wir Fälle entdeckt haben, in denen die Viruspartikelkonzentrationen ursprünglich unter dem kritischen Schwellenwert lagen, anschließend aber eine produktive Infektion festgestellt wurde, was darauf hindeutet, dass p24, das durch digitalen ELISA erkannt wurde, nicht ignoriert werden sollte. Es ist wichtig zu beachten, dass in unserer Studie keine Virusinhibitoren verwendet wurden, was bedeutet, dass wir die anfängliche Burst-Größe ohne laufende Ausbreitung nicht ermitteln konnten. Unsere Daten zeigen, dass der digitale ELISA virale Antigene unterhalb des kritischen Schwellenwerts erkennt, der für die Etablierung eines exponentiellen Wachstums erforderlich ist, was darauf hindeuten könnte, dass Ex-vivo-Kultursysteme im Vergleich zu Lymphgewebe bei Menschen mit HIV-1 weniger tolerant für die Reaktivierung, Replikation und Ausbreitung von HIV-1 sind. Das Versäumnis, ein Ex-vivo-Wachstum zu etablieren, spiegelt jedoch möglicherweise nicht die Fähigkeit des freigesetzten Virions wider, eine Replikation im Lymphgewebe zu etablieren, wo die Bedingungen und die räumlich-zeitliche Dynamik der HIV-Vermehrung möglicherweise günstiger sind57. Es müssen noch direkte Beweise erbracht werden, um festzustellen, ob der digitale ELISA in der Lage ist, anfängliche Virusausbrüche in Gegenwart viraler Inhibitoren zu erkennen, und ob Viruspartikel, denen es nicht gelingt, ex vivo eine exponentielle Replikation zu etablieren, intakt und in der Lage sind, sich in vivo zu erholen.

Ebenso nutzt der Panther Aptima HIV-1 Quant Dx Assay eine transkriptionsvermittelte Target-Capture-Amplifikation (TMA) und eine Echtzeitdetektion, die durch die gezielte Ausrichtung auf hochkonservierte Regionen der HIV-1-Polymerase (pol) und Long Terminal Repeat (LTR)36 vermittelt wird könnte darauf hindeuten, dass Proben mit niedrigen p24-Konzentrationen keine leeren Viruspartikel darstellen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein Teil der Viruspartikel, der nur mit digitalem ELISA gemessen werden kann, möglicherweise replikationskompetent ist, ähnlich den Ergebnissen mit hochempfindlichen zellfreien HIV-RNA-Quantifizierungsmethoden58. Darüber hinaus stimmte das Wachstum in Simoa-positiven Vertiefungen, wie durch SGS-Analyse festgestellt wurde, nicht mit zuvor erkannten Varianten überein und zeigte darüber hinaus mehr Sequenzknoten, was auf die Reaktivierung eines vielfältigeren Pools von HIV-1-Proviren schließen lässt. Vor dem Hintergrund einer vielfältigen Provirenpopulation deuten die beiden Fälle, in denen vier identische HIV-1-Genomsequenzen identifiziert wurden, wahrscheinlich auf die Induktion eines replikationskompetenten Provirus hin. Darüber hinaus könnte das Vorhandensein einzelner Nukleotidunterschiede zu diesen identischen Sequenzen eine schwelende Replikation unterhalb des für exponentielles Wachstum erforderlichen Schwellenwerts erklären.

Derzeit ist die QVOA zwar arbeits- und ressourcenintensiv, liefert aber nur minimale Messungen des latenten Reservoirs, und das exponentielle Wachstum in der QVOA gilt derzeit als Goldstandardmethode zur Messung des wirklich replikationsfähigen Reservoirs. Angesichts der Tatsache, dass die Entwicklung kostengünstigerer, empfindlicherer Assays mit höherem Durchsatz für die Messung des latenten HIV-1-Reservoirs in klinischen Studien von erheblicher Bedeutung ist, wurden bei der Entwicklung von Verbesserungen des QVOA bemerkenswerte Fortschritte erzielt. Einige Ansätze nutzen alternative Stimulationsmethoden59, sequenzierungsbasierte Methoden60 und humanisierte Mäuse, um replikationskompetente Viren zu erkennen61,62. Basierend auf den Erkenntnissen, dass Effektor-Gedächtnis-T-Zellen einen höheren Anteil an induzierbarem HIV-163 enthalten, hat unser Labor kürzlich unabhängig einen modifizierten QVOA entwickelt und qualifiziert, der als Differenzierungs-QVOA oder dQVOA50 bezeichnet wird. Der Assay beinhaltet einen Zytokin-Cocktail, der auf die Ex-vivo-Differenzierung ruhender CD4+-T-Zellen in die Effektor-Gedächtnispopulation vor der globalen Stimulation und dem Virusauswuchs abzielt, wodurch die Messungen reaktivierter und replikationskompetenter Reservoire um das bis zu 18-fache erhöht werden, während die binäre Well-Bewertung durch konventionelle Methoden fortgesetzt wird ELISA. Angesichts der Tatsache, dass der digitale Immunoassay eine durchschnittliche siebenfache Steigerung der HIV-Reservoirmessungen im Vergleich zum herkömmlichen ELISA in Verbindung mit Standard-QVOA ergab und kürzlich ein großer Anteil genetisch intakter HIV-1-Proviren in CD4+-T-Zellen im Effektorgedächtnis entdeckt wurde55, könnte die Kopplung des digitalen ELISA mit dQVOA zu weiteren Ergebnissen führen Anstieg der HIV-1-Reservoirmessungen.

Die meisten derzeit zur Beurteilung der HIV-1-Persistenz verwendeten Tests basieren auf HIV-1-DNA oder -RNA. Während solche Assays bei der Bewertung der HIV-1-Persistenz wirksam sind und eine eingehende Analyse der Sequenzdiversität, Kopienzahl, Integrationsdiversität, Genomintaktheit und Diversität von RNA-Spezies unterstützen12,64,65,66,67, sind sie in ihrer Wirkung begrenzt Bewertung translatorisch kompetenter Reservoire. Bis vor kurzem war die Verwendung von Tests zur Messung translatorischer Viren begrenzt, da die Nachweisgrenze nicht annähernd an die von Nukleinsäure-basierten Tests heranreichte. Nach unserem besten Wissen ist die Simoa-Plattform das einzige ELISA-basierte System, das die Messung des HIV-Gag-Proteins mit einer Empfindlichkeit ermöglicht, die mit der von Nukleinsäure-basierten Tests vergleichbar ist22,23,68,69. Obwohl die Replikationskompetenz durch diese Studien nicht bestätigt wurde und eine Definition der HIV-Reaktivierung im Hinblick auf die Menge an Zellen, die p24 produzieren können, noch nicht als Endpunkt bei der Bewertung von Ansätzen zur HIV-1-Eradikation festgelegt wurde, ist bekannt, dass eine anhaltende p24-Expression vorliegt trägt zur chronischen Immunaktivierung und zur HIV-1-Pathogenese bei26,70,71,72. Simoa bietet die Möglichkeit, p24-produzierende Zellen zu überwachen, indem die Konzentration von HIV-1 p24 im Überstand auf Zellkulturebene, intrazellulärer Ebene24 sowie in Plasma und Serum21,22 gemessen wird, wenn der herkömmliche Immunoassay kein quantifizierbares Ergebnis liefern würde. Darüber hinaus wurde argumentiert, dass die In-vitro-Replikationskompetenz ein unwirksamer Ersatz für die In-vivo-Rebound-Fähigkeit sei11,16. Interessanterweise wurde kürzlich über einen ultraempfindlichen Immunoassay für das p27-Kapsid des Simian Immunodeficiency Virus (SIV) berichtet73, der in seiner vorliegenden Form zur Identifizierung von SIV p27 Gag in Kulturüberständen unter Verwendung von Ex-vivo-Zellen von SIV- oder Simian HIV (SHIV) verwendet werden kann )-infizierte nichtmenschliche Primaten auf supprimierendem cART kombiniert mit der Fähigkeit, Phänotypen von Post-Treatment-Controllern zu beurteilen. Darüber hinaus sind eine kürzliche 27-fache Verbesserung der Empfindlichkeit74 des digitalen HIV-1-p24-Assays sowie ein erhöhter Durchsatz und eine Miniaturisierung75 des Assays dazu geeignet, die Simoa-Plattform als einzigartiges Instrument zur Messung der Virusproduktion im Sub-Pikogramm-Bereich zu positionieren.

Wir sind uns bewusst, dass unsere Studie Einschränkungen aufweist. Da wir die Panther HIV-1-RNA-Analyse nur an ausgewählten Proben durchgeführt haben, können wir keine Schätzung der Häufigkeit falsch verpackter Virionen abgeben, die wahrscheinlich auf eine fehlerhafte Provirus-Reaktivierung zurückzuführen ist. Dieses Problem muss jedoch gegen Haushaltserwägungen und zusätzliche technische Herausforderungen abgewogen werden. Die Einbeziehung von Überstands- und proviraler Sequenzierung könnte zu einer erhöhten Empfindlichkeit auf Kosten höherer Kosten und eines höheren Zeitaufwands führen. Dieser Ansatz würde es ermöglichen, einen Anteil defekter und intakter Proviren zu ermitteln, die in der Lage sind, die kritische Wachstumsschwelle zu erreichen und eine Infektion erfolgreich zu etablieren. In unseren Analysen lässt die Einzelgenomsequenzierung von Kulturüberständen auf eine Virusreplikation zu Beginn des Tests schließen. Angesichts des Fehlens eines exponentiellen Wachstums in den folgenden Tagen ist es jedoch möglich, dass die Kulturbedingungen nicht optimal für die Induktion einer ausreichenden Anzahl replikationsfähiger Proviren waren, um den Übergang zum exponentiellen Wachstum zu ermöglichen. Alternativ könnte es sein, dass in QVOA-Kulturen, die durch konventionellen ELISA positiv sind, die HIV-Variante mit der besten Fitness letztendlich den Rest der induzierten Varianten übertrifft, wohingegen in einer QVOA-Kultur, die durch Simoa positiv ist, die HIV-Varianten zwar vielfältiger, aber unterschiedlicher sind geringere Fitness. Anschließend sind solche Varianten nicht in der Lage, die Wachstumsschwelle zu überschreiten und es gelingt ihnen nicht, sich produktiv in der Kultur auszubreiten. Darüber hinaus können wir nicht ausschließen, dass die Rekombination verschiedener Virusvarianten in derselben Vertiefung zu einer sich ausbreitenden Infektion führt. Eine kürzlich durchgeführte Studie, in der autologe Antikörper zur Kontrolle der Störeffekte der Rekombination eingesetzt wurden, konnte die Zusammensetzung des latenten Reservoirs weiter bestimmen76. Zukünftige Studien, die diesen Ansatz mit der Nutzung der Simoa-Plattform kombinieren, könnten zu weiteren Fortschritten beim Verständnis der HIV-Latenz führen.

Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass der hochempfindliche HIV-1-p24-ELISA ein wertvolles Instrument in einem mehrstufigen Ansatz zur Charakterisierung und Quantifizierung der Konzentrationen translatorisch kompetenter und möglicherweise replikationskompetenter Viren sein kann, wenn herkömmliche Methoden keine quantifizierbaren Messwerte liefern. Zusätzliche Modifikationen wie Immunpräzipitation69 und die Verringerung der Einfangkügelchen in Kombination mit einer hocheffizienten Kügelchenanalyse74 könnten zu weiteren Steigerungen der Assay-Empfindlichkeit führen und sie auf das Niveau von Nukleinsäuretests bringen, mit dem Vorteil der Messung der Freisetzung reifer HIV-Virionen. Daher könnte die Verwendung einer digitalen ELISA-Auslesung, mit der HIV-1 p24 unterhalb des für die Etablierung eines Auswuchses in der Kultur erforderlichen Schwellenwerts nachgewiesen und quantifiziert werden kann, eine Schlüsselkomponente in einem vielschichtigen Ansatz zur Messung der Wirksamkeit von Interventionen zur Behandlung und Prävention sein in klinischen Studien zur HIV-Heilung.

Für den Zweck dieser Studie wurden kryokonservierte PBMCs von sechs HIV-1-infizierten Teilnehmern unter supprimierender cART und einem HIV-1-negativen Spender gewonnen. Ein HIV-1-infizierter Spender stammte aus der RV130/514-Studie (NCT01013415). Fünf HIV-1-infizierte und ein HIV-1-negativer Spender stammten vom HIV Reservoir Assay Validation and Evaluation Network (RAVEN). Dieser Probensatz umfasste ein breites Größenspektrum replikationsfähiger Reservoirs, um die Wiederholbarkeit zwischen Laboren und die Präzisionsanalyse innerhalb des Labors zu bewerten34. Klinische Merkmale und HIV-1-Reservoirgrößen für die fünf RAVEN-Teilnehmer wurden bereits veröffentlicht9. Der Infektionsstatus wurde durch geeignete Antigen-/Antikörper- und Nukleinsäuretests bestätigt.

Die Probenahme der RAVEN-Kohorte wurde vom UCSF-Ausschuss für Humanforschung (IRB Nr. 10-03244) überwacht und genehmigt. Arbeiten im Zusammenhang mit der RV130/514-Studie (NCT01013415) wurden vom Walter Reed Army Medical Center, dem Walter Reed National Military Medical Center, dem Walter Reed Army Institute of Research und den institutionellen Prüfungsausschüssen der Uniformed Services University genehmigt. Alle Untersuchungen wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Alle Studienteilnehmer gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab.

Der Quantitative Viral Outgrowth Assay (QVOA) wurde wie zuvor beschrieben30 mit geringfügigen Änderungen durchgeführt. Kurz gesagt, kryokonservierte PBMCs von HIV-1-infizierten oder HIV-1-negativen Spendern wurden aufgetaut und über Nacht in Komplettmedium (R10) kultiviert, das aus RPMI 1640-Medium mit GlutaMAX™-Ergänzung (Gibco, 61870-036), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem Medium, bestand fötales Rinderserum (Peak Serum, PS-FB1), 1 % Penicillin und 1 % Streptomycin (Gibco, 15140-122). Für die RAVEN-Kohorte34,77 wurden CD4+-T-Zellen durch negative Selektion (Human CD4+ Isolation Kit, Miltenyi Biotec, 130-096-533) aus Massen-PBMC isoliert, gefolgt von einer Anreicherung ruhender CD4+ (rCD4+)-T-Lymphozyten durch Depletion von Zellen, die HLA- exprimieren. DR (Anti-HLA-DR MircoBeads, Miltenyi Biotec, 130-046-101), CD25 (CD25 Microbead Kit, Miltenyi Biotec, 130-092-983) und CD69 (CD69 Microbead Kit, Miltenyi Biotec, 130-092-355). ). Für den Teilnehmer der RV130/514-Studie wurden ruhende CD4+-T-Zellen durch negative, magnetische Kügelchentrennung unter Verwendung von EasySep™D-Magnetpartikeln (Stammzellen, 17962 und 19250) angereichert. Bei allen Tests wurde die Reinheit der Anreicherung durch Durchflusszytometrieanalyse beurteilt. Für jeden Assay wurden rCD4+ T-Zellen in bis zu 22 Replikaten mit 1 × 106 Zellen pro Well (A-Wells), 2 Replikaten mit 2 × 105 Zellen pro Well (B-Wells), 2 Replikaten mit 4 × 104 Zellen pro Well ( C-Wells), 2 Replikate mit 8 × 103 Zellen pro Well (D-Wells), 2 Replikate mit 1,6 × 103 Zellen pro Well (E-Wells), 2 Replikate mit 320 Zellen pro Well (F-Well) und 2 Replikate der Negativkontrolle Vertiefungen ohne rCD4+ T-Zellen (G-Vertiefungen) in R10, ergänzt mit 100 IU/ml rekombinantem humanem IL-2 (R&D Systems, 202-IL), 1–1,2 % T-Zell-Wachstumsfaktor (TCGF) (erzeugt wie zuvor beschrieben30) und 0,5 µg/ml PHA (ThermoFisher Scientific, R30852801 oder Sigma-Aldrich, L1668-5MG). Allogene Mischungen von γ-bestrahlten PBMCs von HIV-seronegativen Spendern (Bioreclamation oder New York Blood Center) sorgten in jeder Vertiefung für eine Kostimulation im Verhältnis 10:1. Nach einer Inkubation über Nacht für mindestens 16 Stunden wurde PHA durch einen Medienwechsel abgewaschen und CD8-abgereicherte (ThermoFisher Scientific, 11147D), PHA-aktivierte Lymphoblasten (Zielzellen) wurden zur Virusamplifikation hinzugefügt. Die Tests wurden gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll30 bis zu 20 Tage lang aufrechterhalten, mit den zusätzlichen Schritten der Sammlung des Überstands an Medien- und Zellaustauschtagen. Nach Abschluss des Tests wurde das p24-Antigen in den Überständen jeder Vertiefung entweder durch konventionellen ELISA (PerkinElmer, NEK050B001KT) gemäß den Anweisungen des Herstellers oder durch ultraempfindlichen digitalen ELISA wie unten beschrieben quantifiziert. Die konventionelle ELISA-Positivität wurde basierend auf einer Cut-off-HIV-1-p24-Konzentration von ≥ 3,25 pg/ml als positiv oder negativ bewertet.

HIV-1 p24 in QVOA-Kulturüberständen wurde mit dem Simoa HIV p24 Kit (Quanterix, Produktnummer 102215, Chargennummer 500621 für die Erstbewertung der Plattform und Chargennummer 500802 für das Überstandsscreening) auf der Simoa HD-1-Plattform (Quanterix) quantifiziert Simoa HD-1 1.5.16006.30001 × 64) gemäß Herstellerangaben. Kurz gesagt, QVOA-Kulturüberstände, Standardkurvenkalibratoren und Qualitätskontrollproben wurden auf Raumtemperatur gebracht, kurz gevortext, um eine Homogenisierung sicherzustellen, und 5 Minuten lang bei 10.000 RCF bei Raumtemperatur zentrifugiert, um unlösliche Partikel vor der Verwendung zu entfernen. Insgesamt 350 µl jedes Kulturüberstands, Referenzkalibrators, Komplettmediums oder Qualitätskontrolle wurden in die 96-Well-Platte (im Lieferumfang des Simoa HD-1 Disk Kit, Quanterix 100227-2 enthalten) geladen und mit X-Pierce Sealing versiegelt Filme (Excel Scientific, XP-100). Ohne Anpassung wurde die Definition des zweistufigen HIV-1-p24-HD-1-Assays verwendet, um zwei Replikate jeder Probe zu analysieren. In jedem Lauf wurden Referenzkalibratoren für die Erstellung der Standardkurve und zwei Qualitätskontrollproben mit niedriger und hoher Konzentration einbezogen, um eine konsistente Leistung des digitalen Assays während der gesamten Studie sicherzustellen. Darüber hinaus wurde für alle Proben mehrerer Tests dieselbe Charge des Simoa HIV p24 Kits verwendet. Zu den Qualitätskontrollprüfungen nach dem Lauf gehörten die Überprüfung der Standardkurven-Akzeptanzkriterien (R2 > 0,98), die Bestätigung der Standardkurve, Qualitätskontrollen, Proben-CVs (< 20 %), die Überwachung von Umgebungstemperatur und Luftfeuchtigkeit während des Laufs sowie die Anpassung der Assay-Definition Konzentrationen auf die der Kit-Charge, zusätzlich zur Bewertung aller relevanten Fehler während der Analyse (z. B. zu viel Fluoreszenz wird als positiv bewertet und Fluoreszenz unterhalb der Standardkurve wird als negativ bewertet) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Mithilfe der 1/y2-gewichteten Vier-Parameter-Logistik-Regressionsanpassung (4PL) wurde die Konzentration von p24 in den Kulturüberständen mithilfe der Softwareanalyse des Herstellers abgeschätzt. Wells galten als positiv für das Vorhandensein von p24, wenn die Konzentration über 0,0515 pg/ml lag.

Rekombinantes HIV-1-p24-Protein wurde aus dem herkömmlichen ELISA-Kit (Perkin Elmer, NEK050B001KT) erhalten. Die folgenden Reagenzien wurden über das NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH erhalten: Human Immunodeficiency Virus-1 92/BR/014, ARP-1753, bereitgestellt vom UNAIDS Network for HIV Isolation and Characterization und Human Immunodeficiency Virus 1 ( HIV-1), Stamm NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3), ARP-2852, beigesteuert von Dr. M. Martin78. HIV-1-p24-Protein und kultivierte Viren wurden seriell in Vollmedium R10 verdünnt und durch konventionellen und digitalen ELISA bewertet. Darüber hinaus wurde HIV-1 92/BR/014 seriell in Überstand verdünnt, der aus QVOA-Negativkontrollvertiefungen (Testmatrix) entnommen und mittels digitalem ELISA analysiert wurde. Schließlich wurden insgesamt 226 HIV-1-negative Proben, die aus drei unabhängig durchgeführten QVOAs bei einem HIV-1-negativen Teilnehmer entnommen wurden, auf einem Quanterix-Gerät analysiert, um die Häufigkeitsverteilung von HIV-negativen Proben zu bestimmen. Diese Daten wurden dann verwendet, um eine Nachweisgrenze (LOD) des digitalen ELISA im Rahmen von QVOA zu berechnen. Der Ausreißertest von Grubb wurde durchgeführt, um zwei signifikante Ausreißer zu entfernen. Anschließend wurde der LOD berechnet, indem drei Standardabweichungen des Mittelwerts zum maximalen p24-Wert addiert wurden.

HIV-1-RNA in QVOA-Kulturüberständen wurde auf dem vollautomatischen Panther-System unter Verwendung des Aptima HIV-1 Quant-Assays mit einer unteren Quantifizierungsgrenze von 30 Kopien/ml und einer oberen Quantifizierungsgrenze von 10.000.000 Kopien/ml (Hologic, San.) quantifiziert Diego, Kalifornien). Aufgrund des geringen verfügbaren Volumens für jede Probe wurden 0,3 ml Kulturüberstand vor dem Test mit der 1:3-Option auf dem Panther-System dreifach mit Aptima-Probenverdünnungsmittel (Hologic, PRD-03003) verdünnt, wobei die Gerätesoftware automatisch die unverdünnte Flüssigkeit meldet Konzentration durch Anwendung des Verdünnungsfaktors.

Die Einzelgenomsequenzierung (SGS) von HIV-1 p6-PR-RT wurde wie zuvor beschrieben79,80 durchgeführt. Die Sequenzen wurden mit ClustalW ausgerichtet. Mit MEGA6 wurden nachbarschaftliche phylogenetische Analysen durchgeführt. Bäume wurzelten auf der Konsensussequenz des Subtyps B.

Die gesamten HIV-DNA-Spiegel wurden durch quantitative PCR wie zuvor beschrieben81 gemessen. Kurz gesagt, Zellpellets wurden unter Verwendung eines Proteinase-K-Lysepuffers verdaut. Die gesamte HIV-1-DNA wurde unter Verwendung spezifischer Primer in der 5'-LTR-gag-Sequenz quantifiziert und integrierte DNA wurde unter Verwendung von Alu-gag-spezifischen Primern amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden durch spezifische Sonden nachgewiesen und die Ergebnisse wurden auf die Anzahl der Kopien des CD3-Gens (2 Kopien pro Zelle) normalisiert.

Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism v9.3.1 durchgeführt. Der Grubbs-Test wurde durchgeführt, um signifikante Ausreißer zu entfernen. Zur Bestimmung der Anpassungsgüte wurde eine einfache lineare Regression durchgeführt und zur Bestimmung der Signifikanz für die Korrelationsanalyse ein zweiseitiger P-Wert ermittelt. Die Häufigkeiten der infektiösen Einheiten pro Million (IUPM) wurden mit dem IUPMStats v1.0 Infection Frequency Calculator35 berechnet.

Alle relevanten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Für die phylogenetische Analyse verwendete HIV-Sequenzen wurden bei der GenBank mit den Zugangsnummern OQ866407-OQ866521 und OQ920078-OQ920090 hinterlegt.

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Diese Arbeit wurde mit Bundesmitteln des NIH/NIAID/DAIDS im Rahmen des Vertrags HHSN272201500017C mit dem Titel „Quantitative Viral Outgrowth Assay (QVOA) Service Resource“ – Dr. Betty Poon (COR). Diese Arbeit wurde außerdem durch interne Mittel des NIH/NCI an Dr. Mary F. Kearney unterstützt. Hologic stellte Reagenzien und Unterstützung für den HIV-RNA-Viruslasttest der QVOA-Kulturüberstände mithilfe des Aptima-Assays auf der Panther-Plattform bereit. Diese Arbeit wurde mit Mitteln des Bill and Melinda Gates Foundation Award INV-008500 (an MPB) unterstützt. Die RV130-Studie wurde vom Infectious Disease Clinical Research Program (IDCRP) durchgeführt, einem Programm des Verteidigungsministeriums (DoD), das von der Uniformed Services University of the Health Sciences (USUHS) im Rahmen einer Kooperationsvereinbarung der Henry M. Jackson Foundation für durchgeführt wird Advancement of Military Medicine, Inc. (HJF). RV130 wurde mit Bundesmitteln des National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health (NIH), im Rahmen der Inter-Agency Agreement Y1-AI-5072 finanziert. Die RV514-Studie wurde durch das Military HIV Research Program unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Arbeit von UM1AI164562 unterstützt, kofinanziert vom National Heart, Lung and Blood Institute, dem National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke, dem National Institute on Drug Abuse und dem National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten (an DAK und YVK). Wir danken Dr. Betty Poon und Roger Miller für ihren intellektuellen Input und ihre Diskussionen während dieses Projekts. Wir danken Krupa Subramanian, Christine Raney, Hayley P. Blankenship, Chunsheng Huang und Jiayi Wei für ihr technisches Fachwissen sowie Ellen R. Nordgren und Rachel L. Jarret für ihre Unterstützung bei der Bereitstellung klinischer Probenverwaltung.

Michael J. Bale

Aktuelle Adresse: Laboratory of Epigenetics and Immunity, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Emory National Primate Research Center, Emory University, Atlanta, GA, USA

Yury V. Kuzmichev und Deanna A. Kulpa

Abteilung für Infektionskrankheitsforschung, Southern Research, Frederick, MD, USA

Yury V. Kuzmichev, Carol Lackman-Smith, Roger G. Ptak und Elizabeth R. Wonderlich

Vitalant Research Institute, San Francisco, Kalifornien, USA

Sonia Bakkour, Mars Stone und Michael P. Busch

Abteilung für Labormedizin, University of California San Francisco, San Francisco, CA, USA

Sonia Bakkour, Mars Stone und Michael P. Busch

HIV Dynamics and Replication Program, NCI am Frederick, NIH, Frederick, MD, USA

Ann Wiegand, Michael J. Bale, Andrew Musick und Mary F. Kearney

Uniformed Services University, Bethesda, MD, USA

Wendy Bernstein und Naomi Aronson

Walter Reed National Military Medical Center, Bethesda, MD, USA

Wendy Bernstein und Naomi Aronson

HIV-Forschungsprogramm des US-Militärs, Walter Reed Army Institute of Research, Silver Spring, MD, USA

Julie Ake & Sodsai Tovanabutra

Abteilung für Pathologie und Labormedizin, Emory University School of Medicine, Atlanta, GA, USA

Deanna A. Fehler

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YVK trug zur Konzeptualisierung, formalen Analyse, Untersuchung, Methodik, zum Schreiben (ursprünglicher Entwurf) und zur Visualisierung bei. ERW trug zur Konzeptualisierung, formalen Analyse, Methodik, Projektverwaltung, Überwachung, Visualisierung und zum Schreiben bei (ursprünglicher Entwurf). DAK trug zur Konzeptualisierung, formalen Analyse, Finanzierungseinwerbung, Methodik, Projektverwaltung, Überwachung und dem Schreiben bei (ursprünglicher Entwurf). CL-S. trug zur Datenkuration, formalen Analyse und Methodik bei. AW, MJB und AM führten eine Analyse und Visualisierung der Einzelgenomsequenzierung durch. RGP trug zur Finanzierungsbeschaffung, Methodik und Projektverwaltung bei. MS und SB führten eine HIV-1-RNA-Quantifizierung auf dem Panther-System durch. NA und JA trugen zur Untersuchung bei und stellten Teilnehmerproben aus der RV130/514-Studie zur Verfügung. WB und ST trugen zur Untersuchung bei. ST führte eine Gesamt- und integrierte HIV-DNA-Messung durch. MFK trug zur Methodik und Aufsicht bei. MPB stellte Teilnehmerproben aus der RAVEN-Kohorte zur Verfügung. Alle Autoren haben zur kritischen Prüfung und Bearbeitung des Manuskripts beigetragen.

Korrespondenz mit Yury V. Kuzmichev oder Deanna A. Kulpa.

Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen. Die geäußerten Ansichten sind die der Autoren und sollten nicht so ausgelegt werden, dass sie die Positionen der Uniformed Services University, des Verteidigungsministeriums, der US-Armee oder der Regierung der Vereinigten Staaten repräsentieren. Die Ermittler haben sich an die Richtlinien zum Schutz menschlicher Subjekte gehalten, die in der Armeeverordnung 70-25 vorgeschrieben sind.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kuzmichev, YV, Lackman-Smith, C., Bakkour, S. et al. Die Anwendung des hochempfindlichen digitalen ELISA für p24 ermöglicht eine verbesserte Bewertung der Diversität des HIV-1-Reservoirs und der Wachstumskinetik in Viruswachstumstests. Sci Rep 13, 10958 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37223-9

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Eingegangen: 22. August 2022

Angenommen: 18. Juni 2023

Veröffentlicht: 06. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37223-9

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