Die Wahl des 16S-rRNA-Genprimers wirkt sich aus

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12577 (2023) Diesen Artikel zitieren

67 Zugriffe

Details zu den Metriken

Die 16S-rRNA-Amplikonsequenzierung oder neuerdings auch die metatranskriptomische Analyse sind derzeit die einzigen bevorzugten Methoden zur mikrobiellen Profilierung von Proben, die ein überwiegendes Verhältnis von menschlicher zu bakterieller DNA enthalten. Aufgrund der Off-Target-Amplifikation menschlicher DNA sind die aktuellen Protokolle jedoch für bioptische Proben unzureichend. Hier stellen wir eine effiziente, zuverlässige und kostengünstige Methode für die Bakteriomanalyse klinischer Proben vor, bei denen der Gehalt an menschlicher DNA überwiegt. Wir haben das Mikrobiota-Profil in insgesamt 40 menschlichen Biopsien der Speiseröhre, des Magens und des Zwölffingerdarms mithilfe der 16S-rRNA-Amplikonsequenzierung mit den weit verbreiteten 515F-806R (V4)-Primern, die auf die V4-Region abzielen, 68F-338R-Primern und einem modifizierten Satz von bestimmt 68F-338R (V1-V2M)-Primer, die auf die V1–V2-Region abzielen. Mit den V4-Primern wurden durchschnittlich 70 % der Amplikonsequenzvarianten (ASV) im menschlichen Genom kartiert. Andererseits fehlte diese Off-Target-Amplifikation bei Verwendung der V1-V2M-Primer. Darüber hinaus sorgten die V1–V2M-Primer im Vergleich zu den V4-Primern für eine deutlich höhere taxonomische Vielfalt und Reproduzierbarkeit der Analyse. Wir kommen zu dem Schluss, dass die V1-V2M-16S-rRNA-Sequenzierungsmethode zuverlässig, kostengünstig und für menschliche Proben mit geringem Bakterienreichtum in der medizinischen Forschung anwendbar ist.

Im letzten Jahrzehnt hat sich die Untersuchung des menschlichen Bakterioms mithilfe kulturunabhängiger Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden zu einer der am häufigsten verwendeten Techniken zur Untersuchung von Bakteriengemeinschaften entwickelt, die in einer Vielzahl von Nischen im menschlichen Körper leben1,2. Der Zugang zu Technologien der dritten Generation in Verbindung mit den sinkenden Kosten im Zusammenhang mit der Hochdurchsatzsequenzierung hat zu einer Verlagerung von der Amplikon-16S-rRNA-Gensequenzierung hin zur Sequenzierung des gesamten 16S-rRNA-Gens und der metagenomischen/metatranskriptomischen Sequenzierung in Proben wie Stuhl, menschlicher Vagina3 oder Abstrichen geführt die Haut oder die Mundhöhle4, die einen überwiegenden Anteil an menschlicher und bakterieller DNA enthalten. Bei Proben mit geringen Konzentrationen an bakterieller DNA oder solchen, die durch Wirts-DNA „kontaminiert“ sind, wie Blut, Urin oder menschliche Biopsieproben, beruht die Bakteriomprofilierung jedoch immer noch weitgehend auf der 16S-rRNA-Gensequenzierung. Da die erzeugte Datenmenge relativ gering ist, ist keine komplexe bioinformatische Analyse erforderlich5 und der Preis ist auch erschwinglicher. Andererseits hängen die Ergebnisse der 16S-rRNA-Amplikonsequenzierung entscheidend von der Auswahl der hypervariablen Unterregionen aus den neun verfügbaren variablen Regionen ab, die in der hochkonservierten 16S-rRNA-Gensequenz verstreut sind, sowie von der Qualität der abgerufenen Informationen und der Taxonomie Die Genauigkeit kann je nach verwendetem Primer-Set(s) erheblich variieren6. Derzeit zielt die überwiegende Mehrheit der Studien entweder auf die einzelne variable Region V4 ab, wie im weit verbreiteten standardisierten Protokoll des Earth Microbiome Project (EMP)7, oder auf die variablen Regionen V1–V38 oder V3–V59, wie im Dual-Indexing-Protokoll des Human Microbiome Projekt (HMP). Dies liegt vor allem daran, dass die weit verbreitete Sequenzierungsplattform Illumina nur kurze Sequenzen produziert (NextSeq, MiniSeq, iSeq ≤ 300 Basen und MiSeq ≤ 600 Basen). Leider haben neuere Studien wiederholt gezeigt, dass die häufig anvisierte 16S-rRNA-Gen-Subregion V4 die im menschlichen Körper häufig vorkommenden Taxa am wenigsten genau beurteilt6,10,11. Darüber hinaus ist es zusammen mit der Region V3–V5 besonders anfällig für eine Off-Target-Amplifikation menschlicher DNA12, insbesondere in Biopsieproben, was zum potenziellen Verlust seltener Taxa und zur Auflösung von Bakterien führt und somit ein erheblicher Teil der Daten verschwendet wird.

Hier demonstrieren wir ein neues Protokoll mit einem Primer-Set, das auf die 16S-rRNA-Gen-Subregion V1–V2 abzielt und die Off-Target-Amplifikation menschlicher DNA in Biopsieproben aus der Speiseröhre, dem Magen und dem Zwölffingerdarm drastisch verringert und gleichzeitig die Alpha-Diversität und Taxonomie deutlich erhöht Genauigkeit im Vergleich zu den üblicherweise verwendeten Primern, die auf die V4-Region abzielen. Die Amplifikationsprimer für die V1–V2-Region, einschließlich der für die Sequenzierung erforderlichen Funktionalitäten (Durchflusszellenadapter und Indizes), wurden für die Illumina MiniSeq-Plattform mit einer maximalen Leselänge von 150 bp optimiert und bieten eine kostengünstige Option für jedes an einer Durchführung interessierte Labor Hochdurchsatz-16S-rRNA-Gensequenzierung. Um die Leistung taxonomischer Klassifizierungen weiter zu steigern, haben wir die Verkettung von Paired-End-Lesevorgängen in die Bioinformatik-Pipeline aufgenommen13.

Das weit verbreitete standardisierte Protokoll für die Sequenzierung von 16S-rRNA-Gen-Amplikons7,14 erwies sich aufgrund der robusten Off-Target-Amplifikation menschlicher DNA während der Analyse von Bakteriomen in Proben verschiedener Biopsiestellen aus dem oberen Gastrointestinaltrakt als unzureichend. In Proben aus allen drei Arten von Biopsiestellen (Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm) waren durchschnittlich 70 % der Amplikonsequenzvarianten (ASV) an das menschliche Genom angelehnt, in einigen Proben waren es sogar 98 % (Abb. 1A). Dies führte dazu, dass ein erheblicher Teil der Sequenzierungsdaten aus der 16S-rRNA-Genanalyse aufgrund einer falschen taxonomischen Klassifizierung aufgegeben werden musste. Interessanterweise stimmten in den Proben von Adenokarzinomen des Ösophagus (EAC) nur etwa 20 % der ASVs mit dem menschlichen Genom überein (Abb. 1), was auf eine andere bakterielle Repräsentation in der Tumorumgebung schließen lässt, wie bereits zuvor beobachtet wurde15. Das laut BLAST am häufigsten identifizierte ASV war die Mitochondrion-Haplogruppe des Homo sapiens mit einem E-Wert von 6e−83 und 100 % Identität, in der wir Stellen mit signifikanter Ausrichtung auf das verwendete 515F-806R-Primerpaar identifizierten, was die beobachtete Abweichung erklärt. Zielverstärkung (Abb. 1B).

Das Problem der Off-Target-Amplifikation in Proben aus Ösophagus-, Magen- und Zwölffingerdarmbiopsien. (A) Prozentsatz der Amplikonsequenzvarianten (ASVs), die auf das menschliche Genom ausgerichtet sind und durch Illumina MiniSeq 2 × 150 bp-Sequenzierung von Amplikons erzeugt werden, die auf die Regionen V4 und V1–V2 abzielen. E Ösophagus, EAC Ösophagus-Adenokarzinom, S Magen, D Zwölffingerdarm. (B) Ausrichtung der Amplifikationsprimer der V4-Region an der Mitochondrien-Haplogruppe des Homo sapiens; Die Sequenz-ID entspricht der NCBI-Nukleotiddatenbank.

Dieses ungelöste Problem einer erheblichen unspezifischen Amplifikation wurde kürzlich auch bei der Analyse von Brustgewebe- und Speiseröhrenbiopsien unter Verwendung von Primern, die auf die V3–V4-Region abzielen, mit dem standardisierten Protokoll für das Illumina MiSeq-System12 beschrieben. Dies zeigt, dass die Sequenzierung des amplifizierten 16S-rRNA-Gens durch bakterienspezifische Primer zwar eine Alternative zur Überwindung der häufigen Probleme im Zusammenhang mit einer erheblichen Kontamination des Menschen bei der amplifikationsfreien Shotgun-Metagenomik4 darstellt, die Notwendigkeit der Verwendung hoch degenerierter Primer dieses Problem jedoch möglicherweise nicht vollständig beseitigt .

Walker et al. zeigten, dass menschliche Biopsieproben vorzugsweise mit Primern amplifiziert werden sollten, die auf die V1–V2-Region (SD-Bact-0027-bS-20 und SD-Bact-0338-aA-18) statt auf die V3–V4-Region abzielen (Abb. 2). , da sie bei der 16S-rRNA-Gensequenzierung eine geringere Off-Target-Amplifikation menschlicher DNA zeigen12. Sie verwendeten jedoch ein zweistufiges Amplifikationsprotokoll für die V1–V2-Region8, wodurch Amplikons mit einer durchschnittlichen Länge von ≈ 310 bp erhalten wurden, was nicht ideal für Illumina MiniSeq, Nextseq oder iSeq ist – alles kosteneffiziente Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung Plattformen, die nur Sequenzen ≤ 300 Basen produzieren. Wir haben daher einen neuen Amplifikationsprimersatz entwickelt, der auf den zuvor beschriebenen Primern SD-Bact-0049-aS-2116 und SD-Bact-0338-aA-1917 basiert und eine durchschnittliche Amplikonlänge von ≈ 260 bp ergibt, einschließlich geeigneter Zelladapter und Indizes für ein einstufiges Amplifikationsprotokoll (Abb. 2).

Die Lokalisierung von Primern zur Amplifikation der V1–V4-Regionen des 16S-rRNA-Gens.

Die erneute Analyse aller Biopsieproben aus der Speiseröhre mit diesem V1–V2-Primersatz zeigte, dass die Anzahl der auf das menschliche Genom ausgerichteten ASVs an allen Biopsiestellen praktisch auf Null sank (Abb. 1A). Insbesondere als Walker et al. verwendeten die Primer SD-Bact-0027-bS-20 und SD-Bact-0338-aA-18, wobei etwa 30 % der Lesevorgänge immer noch auf menschliche DNA ausgerichtet waren12. Tatsächlich zeigte die durch die Sequenzierungsdaten der V1-V2- und V4-Primerpaare erstellte Verdünnungskurve deutlich mehr ASVs in Proben, die mit den V1-V2-Primern amplifiziert wurden (ergänzende Abbildung S1), und diese Primer weisen durchweg auch deutlich höhere Alpha-Diversitätsindizes auf im Vergleich zu Primern, die auf die V4-Region abzielen (Abb. 3A), was die zuvor beobachtete höhere taxonomische Auflösung bestätigt6. Die Analyse der zehn am häufigsten vorkommenden Phyla in beiden analysierten Regionen entsprach der typischen Bakterienzusammensetzung des oberen Gastrointestinaltrakts (GI)18,19,20,21,22. Der paarweise Vergleich von mit V1–V2- und V4-Primern amplifizierten Proben zeigte eine signifikant höhere Repräsentation von Actinobakterien und Proteobakterien, eine geringere Repräsentation von Phylum Bacteroidota und das Fehlen des Phylum Fusobacteriota in mit V1–V2-Primern amplifizierten Proben (Abb. 3B). Ähnliche Unterschiede wurden in neueren Studien zur Analyse der Bakteriomstruktur von Ösophagusbiopsien zwischen den mit V423,24- oder V3–V425,26-Primern analysierten Proben beobachtet, wenn unsere Ergebnisse aus der V1–V2-Region sehr nahe am Bakteriomprofil von Li et al. liegen al. analysiert mit den V3–V4-Primern26 aus Ösophagusbiopsien. Aufgrund des völligen Fehlens von Proben, die mit V1–V2-Primern des Stammes Fusobacteriota amplifiziert wurden, in der Mikrobiota der Speiseröhre27 führten wir jedoch ein Alignment beider V1–V2-Primer mit dem 16S-rRNA-Gen von Fusobacteriota durch. Dies zeigte eine Zwei-Basen-Fehlpaarung am 3'-Terminus des SD-Bact-0049-aS-21-Primers und daher entwarfen wir einen zusätzlichen Vorwärtsprimer 68F_M (Tabelle 1), der auf Fusobacteriota abzielte, und verstärkten zusammen mit den ursprünglichen Primern erneut die gesamte Biopsie Proben aus der Speiseröhre. Die Gemeinschaftsstruktur in Proben, die mit dieser modifizierten Mischung von V1–V2-Primern (V1–V2M) amplifiziert wurden, zeigte dank der Amplifikation von Phylum Fusobacteriota deutlich mehr beobachtbare Arten (Abb. 3A), obwohl das Profil im Allgemeinen dem mit dem Original erhaltenen Profil ähnelte V1–V2-Primer (Abb. 3B).

Vergleich von Ösophagusproben unter Verwendung von Primern, die auf die Regionen V1–V2 und V4 des 16S-rRNA-Gens abzielen. (A) Vergleich der durchschnittlichen Alpha-Diversitätsindizes zwischen den mit V1–V2- und V4-Primern amplifizierten Proben. (B) Durchschnittliche Probenzusammensetzung auf Phylum-Ebene – die zehn am häufigsten vorkommenden Phyla werden angezeigt. Statistische Tests wurden mit dem Wilcoxon-Test durchgeführt (***< 0,001, **< 0,01, NS nicht signifikant).

Als nächstes analysierten wir die Struktur der Bakteriengemeinschaft, die mithilfe der Primer V1–V2M und V4 in Biopsieproben der Speiseröhre, des Magens und des Zwölffingerdarms identifiziert wurde, die den gesamten oberen Gastrointestinaltrakt darstellen (Abb. 4). Wir beobachteten einen signifikant höheren geschätzten taxonomischen Reichtum auf Artenebene in Bezug auf alle weit verbreiteten Alpha-Diversitätsindizes für die mit V1–V2M-Primern amplifizierten Ösophagus- und Zwölffingerdarmproben im Vergleich zu V4-Primern (Abb. 4A). Lediglich Magenbiopsieproben zeigten keinen beobachtbaren Unterschied in der taxonomischen Vielfalt zwischen V4 und V1–V2M als Folge der hohen Häufigkeit des Campylobacterota-Stamms (bis zu 95 %, ergänzende Abbildung S2) bei mehreren Patienten. Dies war auf das Vorhandensein des Bakteriums Helicobacter pylori zurückzuführen, dem weit verbreiteten Magenpathogen, das mit dem Risiko einer chronischen Gastritis, eines Magengeschwürs und eines Magenadenokarzinoms verbunden ist28. Da die taxonomische Zusammensetzung des durchschnittlichen oberen Gastrointestinaltrakts zwischen den einzelnen Standorten variierte (Abb. 4B), führten wir eine detaillierte Analyse des taxonomischen Reichtums der Biopsieproben aus der Speiseröhre durch, da diese die größte Gruppe bildeten und bei jedem Patienten an mehreren Standorten gesammelt wurden .

Analyse von Biopsieproben aus dem oberen Gastrointestinaltrakt unter Verwendung von Primern, die auf die V1–V2M- und V4-Regionen des 16S-rRNA-Gens abzielen. (A) Vergleich der durchschnittlichen Alpha-Diversitätsindizes zwischen Proben, die mit V1–V2M- und V4-Primern amplifiziert wurden. Statistische Tests wurden mit dem Wilcoxon-Test durchgeführt (***< 0,001, **< 0,01, NS nicht signifikant). (B) Durchschnittliche Probenzusammensetzung auf Phylum-Ebene – die zehn am häufigsten vorkommenden Phyla werden angezeigt. (C) Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) basierend auf der Jaccard-Distanz; Die statistische Signifikanz wurde durch PERMANOVA nachgewiesen. Alle Analysen wurden anhand von 6 Zwölffingerdarmbiopsien, 11 Magenbiopsien und 23 Ösophagusbiopsien durchgeführt, die mit V1–V2M- und V4-Primern amplifiziert wurden.

Wie aus der Analyse der Verdünnungskurven (ergänzende Abbildung S1) zu erwarten war, zeigten die V1-V2M-Primer einen signifikant höheren taxonomischen Reichtum auf Gattungs- und insbesondere auf Artenebene (Abb. 5A). Bemerkenswerterweise gab es mit V4-Primern keinen Unterschied im taxonomischen Reichtum zwischen der Gattungs- und der Artenebene. Andererseits zeigte die taxonomische Zuordnung beider Primerpaare eine vergleichbare Effizienz auf Gattungs- und Artenebene (Abb. 5B). Als wir jedoch die Reproduzierbarkeit der Analyse an sechs Patienten analysierten, fanden wir eine signifikant höhere Korrelation mit V1-V2M-Primern im Vergleich zu V4-Primern zwischen zwei Ösophagus-Biopsieproben, die von einem Patienten entnommen wurden (Abb. 5C).

Taxonomische Auflösung und Reproduzierbarkeit der Analyse für jeden 16S-rRNA-Gen-spezifischen Datensatz aus Ösophagus-Biopsieproben. (A) Taxonomischer Reichtum (Gattungs- und Artenebene) mit V1–V2M- und V4-Amplikons (n = 36; 4 Proben mit einer hohen Prävalenz von Helicobacter pylori wurden weggelassen). Statistische Tests wurden mit dem Student-T-Test durchgeführt (***< 0,001, **< 0,01) (B) Prozentsatz der Sequenzen mit zugewiesener Taxonomie (Gattungs- und Artenebene) für jeden Amplikon-basierten Datensatz (n = 36; 4 Proben). mit einer hohen Prävalenz von H. pylori wurden weggelassen). Statistische Tests wurden mit dem Student-T-Test durchgeführt; NS nicht signifikant (C) Pearson-Korrelationskoeffizienten, berechnet aus zwei Ösophagus-Biopsieproben, die von einem Patienten für jeden Amplikon-basierten Datensatz entnommen wurden (n = 6). Statistische Tests wurden mit dem Student-T-Test (*< 0,05) durchgeführt.

Diese geringe Reproduzierbarkeit deutet auf eine PCR-Verzerrung bei der Amplifikation einzelner V4-Regionen des 16S-rRNA-Gens als Folge einer massiven Off-Target-Amplifikation hin. Tatsächlich steht dieses Ergebnis im Einklang mit der Sequenzentropie (Variabilität) für die Regionen V1–V2 und V46 und bestätigt frühere Erkenntnisse aus der Analyse von Harn- und Darmmikrobiota, dass das V1–V2 16S rRNA-Gen-Amplikon taxonomisch viel aussagekräftiger ist Reichhaltigkeit im Vergleich zum V4-Amplikon10,11. Andererseits zeigte die Analyse der V1–V2-Region keine schlechte Sequenzklassifizierung bei der Identifizierung von Bakterientaxa, die zum Stamm der Proteobakterien gehören, was in einem früheren In-silico-Experiment auf der Grundlage von 16S-rRNA-Gensequenzen aus einer öffentlichen Datenbank von Greengenes vorhergesagt wurde6 .

In Bezug auf Phyla mit einer durchschnittlichen Repräsentation von mehr als 0,5 % wurden Bacteroidota, Firmicutes, Proteobacteria, Fusobacteriota, Campylobacterota, Actinobacteriota und Spirochaetota in beiden Amplikon-Datensätzen nachgewiesen. Patescibakterien und Cyanobakterien, die nur im V1-V2M-Datensatz nachgewiesen wurden, waren auch im V4-Datensatz vorhanden, ihr Anteil lag jedoch unter 0, 1% (ergänzende Abbildung S3A). Im Fall von Phyla mit geringer Häufigkeit (<0,5 %) waren neun in beiden Datensätzen gemeinsam und einige Phyla wurden ausschließlich in einer Untergruppe mit einer durchschnittlichen relativen Gesamthäufigkeit von nur <0,01 % nachgewiesen (ergänzende Abbildung S3B). Sie wurden hauptsächlich als thermophile Bakterien oder Archaeen beschrieben, die im Boden oder in heißen Quellen vorkommen29,30,31, was entweder auf eine Kontamination oder eine taxonomische Fehlklassifizierung hinweist. Die Auswertung der Schnittmenge zwischen Gattungen mit einer durchschnittlichen Repräsentation von mehr als 0,5 % in den V4- und V1–V2M-Datensätzen ergab, dass 17 Gattungen in beiden Datensätzen vorhanden waren. Die zweitgrößte Gruppe umfasste 16 Gattungen im V1–V2M-Datensatz und 4 Gattungen im V4-Datensatz. Von den 20 in einem Datensatz vorhandenen Gattungen wurden nur zwei (Capnocytophaga und Leptotrichia) im V1–V2M-Datensatz nicht identifiziert und vier (Cutibacterium, Jeotgalicoccus, Pseudomonas und TM7x) wurden im V4-Datensatz nicht identifiziert.

Andererseits beobachteten wir Diskrepanzen zwischen Amplikon-Datensätzen in der Bakterienzusammensetzung nach relativer Taxa-Häufigkeit. Aufgrund dieses erheblichen Unterschieds führten wir eine Beta-Diversitätsanalyse für jede Stelle des oberen Gastrointestinaltrakts (Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm) durch. Unter Verwendung der nach der Jaccard-Distanz geordneten Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) beobachteten wir eine statistisch signifikante Häufung zwischen V4- und V1-V2M-Datensätzen an allen Standorten, die eine Trennung auf Achse1 zeigten (Abb. 4C). Die Analyse signifikant unterschiedlicher Gattungen (P < 0,05, durchschnittliches Vorkommen > 0,5 %) zwischen den Datensätzen aus Ösophagus- und Zwölffingerdarmbiopsien zeigte eine erhöhte Repräsentation der häufig vorkommenden Gattungen Prevotella, Fusobacterium und Streptococcus im V4-Datensatz und Neisseria, Haemophilus und Rothia in der V1–V2M-Datensatz (Abb. 6). Bei Biopsien aus dem Magen beobachteten wir nur im V4-Datensatz eine erhöhte Repräsentation der häufig vorkommenden Gattungen Prevotella und Fusobacterium (Abb. 6). Tatsächlich fehlte die Gattung Tmx7 in allen V4-Datensätzen nahezu und die Gattung Leptotrichia in den V1-V2M-Datensätzen nahezu nicht (Abb. 6).

Unterschiedliche Gattungsdarstellungen zwischen V1–V2M- und V4-Amplikon-spezifischen Datensätzen aus Biopsieproben der Speiseröhre, des Magens und des Zwölffingerdarms. Gattungen, die statistisch unterschiedliche Darstellungen (P < 0,05, analysiert durch den Wilcoxon-Test) zwischen Amplifikaten aus den Regionen V1–V2M und V4 des 16S-rRNA-Gens zeigen, werden im Diagramm entsprechend ihrer Häufigkeit (Basismittelwert – Y-Achse) und ihrer relativen Häufigkeit geordnet Verhältnis (log2FoldChange – X-Achse).

Die erhöhte Repräsentation der Gattung Prevotella spiegelte sich in der erhöhten Repräsentation des Stammes Bacteriodota im V4-Datensatz wider, und ebenso spiegelte sich die erhöhte Repräsentation der Gattungen Neisseria, Haemophilus und Rothia in der erhöhten Repräsentation der Phyla Proteobacteria und Actinobacteria im V1 wider -V2M-Datensatz (Abb. 4B). Basierend auf diesen Ergebnissen überprüften wir die Ausrichtung beider Primersätze, wobei alle Repräsentanten große Diskrepanzen aufwiesen, und stellten fest, dass am 3′-Ende des SD-Bact-0049-aS-21-Primers nur in der Gattung Leptotrichia eine 2-Basen-Fehlpaarung vorliegt , was die beobachtete schlechte Amplifikation dieser Gattung mit V1–V2M-Primern erklärt. Die Unterschiede in der relativen Taxa-Zusammensetzung in den beiden Datensätzen bestätigen frühere Studien, die zeigen, dass der jeweils verwendete 16S-rRNA-Gen-Primer-Satz einen wesentlichen Einfluss auf die Analyse der Bakterienvielfalt und -zusammensetzung hat10,32,33,34,35. Aktuelle Analysen von Bakteriomen in Biopsien aus dem oberen Gastrointestinaltrakt unter Verwendung der Primerpaare V3–V4 oder V4 zeigten, dass die relative Zusammensetzung der Taxa zwischen den einzelnen Primersätzen stark schwankte, wobei im Fall von V4 eine höhere Häufigkeit von Bacteroidota zu verzeichnen war Primer23,24 und höhere Häufigkeit von Actinobakterien und Proteobakterien im Fall von V3–V4-Primern25,26. Ein ähnlicher Trend wurde auch für die Darmmikrobiota-Analyse unter Verwendung der Primer V4–V5 und V3–V4 beschrieben34. Darüber hinaus steht die höhere Repräsentation der Gattung Streptococcus in unserem V4-Datensatz im Einklang mit einer früheren Studie, in der orale und Scheingemeinschaften mithilfe der Illumina MiSeq-Plattform unter Verwendung der 16S-rRNA-Gen-V1–V3- und V3–V4-Primer analysiert wurden, in der die Autoren vermuten, dass die V1 –V3-Region lieferte eine genauere Darstellung der oralen mikrobiellen Vielfalt35.

Wir haben eine im Handel erhältliche Schein-Referenz-Community, ZymoBIOMICS Fecal Reference mit TruMatrix Technology (FRT) und ZymoBIOMICS Gut Microbiome (GM) Standard (Zymo Research, USA), sequenziert, um die Verzerrung bei der auf V1–V2M-Primern basierenden Profilierung der mikrobiellen Zusammensetzung zu bewerten. Die Darstellung jeder Gattung im GM-Standard wurde mit den Daten aus der Sequenzierung der Standards unter Verwendung der Primer V1–V2M und V4 verglichen. Für den FRT-Standard wurden die verfügbaren Rohsequenzierungsdaten auf der Ebene der Gattungen mit einer Häufigkeit von > 1 % analysiert und mit unseren Daten verglichen (Abb. 7). Beide Datensätze V1–V2M und V4 zeigten einen sehr hohen Grad an Korrelation mit den Bakteriengemeinschaften in den beiden Standards (Abb. 7B, D). Im Fall des GM-Standards unterschätzten die V4-Primer die Gattungen Veilonella und Limosilactobacillus leicht und die V1–V2M-Primer die Gattung Bacteroides leicht. Eine Analyse der FRT-Gemeinschaft zeigte eine etwas höhere Repräsentation der Gattungen Bacteroides, Agathobacter und Subdoligranulum im V4-Primerdatensatz und von Anaerostipes im V1–V2M-Datensatz. Im Allgemeinen zeigen diese Ergebnisse jedoch, dass die V1–V2M-Primer vergleichbare Daten wie die V4-Primer liefern.

Vergleich der Bakterienstruktur der ZymoBIOMICS-Standards, analysiert mit den Primern V4 und V1–V2M. ZymoBIOMICS Stuhlreferenz mit TruMatrix-Technologie (FRT) und ZymoBIOMICS Gut Microbiome (GM) Standard (Zymo Research, USA), analysiert durch 16S-rRNA-Gensequenzierung unter Verwendung von V4- und V1-V2M-Primerpaaren und sequenziert auf Illumina MiniSeq (2 × 150 bp). (A,C) Durchschnittliche Probenzusammensetzung auf Gattungsebene – FRT-Standardgattungen, die mehr als 1 % ausmachen, werden angezeigt. (B,D) Streudiagramme der Gattungshäufigkeiten für die Primerpaare V4 und V1–V2M, die für die Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens mit dem Pearson-Korrelationskoeffizienten verwendet wurden.

Die größte Einschränkung dieser und anderer Studien ist in der Regel der Mangel an Informationen über die tatsächliche taxonomische Zusammensetzung der analysierten Probe. Die Auswahl der geeigneten hypervariablen Regionen des 16S-rRNA-Gens für die Analyse ist jedoch ein entscheidender Gesichtspunkt für die Charakterisierung der relevanten Bakteriengemeinschaften und die Beseitigung von Verzerrungen aufgrund einer Off-Target-Amplifikation. Die Entwicklung einer Methodik zur Metagenomanalyse menschlicher Biopsien ist sowohl für die medizinische Forschung als auch für die klinische Praxis von grundlegender Bedeutung. Derzeit verfügbare 16S-rRNA-Gensequenzierungstechniken, einschließlich Sequenzierungsplattformen der dritten Generation (MinION, PacBio), sind für die Untersuchung von Proben mit geringer Bakterienzahl und einem überwiegenden Anteil an menschlicher DNA nicht optimal. In unserer Studie haben wir eine Reihe von Primern für die Amplikon V1–V2 16S rRNA-Gensequenzierung von Bakterien entwickelt, die in menschlichen Biopsien vorkommen, die in Kombination mit den Illumina MiniSeq/Nextseq/iSeq-Plattformen gleichzeitig die Effizienz dieser Methode aufrechterhalten Zeit, den Preis radikal zu senken.

Die Studie wurde mit Genehmigung der Ethikkommission des Universitätsklinikums Brünn durchgeführt (Nr. 05-101019/EK, 15. Mai 2019). Vor der Aufnahme in die Studie wurde von allen Teilnehmern eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt und die Studie steht im Einklang mit der Helsinki-Erklärung. 17 Proben aus der Speiseröhre, 6 Proben aus dem Adenokarzinom der Speiseröhre, 11 Proben aus dem Magen und 6 Proben aus dem Zwölffingerdarm wurden von 7 Patienten mit gastroösophagealer Refluxkrankheit (GERD) und 6 Patienten mit Adenokarzinom der Speiseröhre (EAC) in der Abteilung für Gastroenterologie und Innere Medizin entnommen , Fakultätskrankenhaus Brünn. Die Biopsien wurden in sterile 2-ml-Röhrchen mit 2 g 1,4-mm-Homogenisierungskeramikkügelchen (Qiagen, Hilden, Deutschland) und 600 µL RLT-Lysepuffer aus dem AllPrep DNA/RNA 96 Kit-Isolierungskit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gegeben und eingefroren sofort bei – 80 °C bis zur DNA-Extraktion.

Die Proben wurden auf Raumtemperatur aufgetaut und jeder Probe wurde 2-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) bis zu einer Endkonzentration von 1 % zugesetzt und 2 × 50 s lang bei 6500 U/min unter Verwendung eines Precellys Evolution-Homogenisators (Bertin) mechanisch homogenisiert Technologies SAS, Frankreich). Die Proben (und die DNA-Extraktions-Negativkontrolle) wurden dann für die DNA-Extraktion mit dem AllPrep DNA/RNA 96 Kit (Qiagen Hilden, Deutschland) gemäß dem Spin-Protokoll des Herstellers verarbeitet und die eluierte DNA wurde bis zur weiteren Analyse bei –20 °C gelagert . Der ZymoBIOMICS Fecal Reference Standard (Zymo Research, USA) wurde für die DNA-Extraktion mit dem ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit (Zymo Research, USA) gemäß dem Spin-Protokoll des Herstellers verarbeitet und die eluierte DNA wurde bis zur weiteren Analyse bei –20 °C gelagert.

Genomische DNA wurde in einer PCR-Reaktion mit Primern amplifiziert, die auf die variablen Regionen V1–V2 (68F16-338R17) und V4 (515F-806R36) des 16S-rRNA-Gens abzielten. Die Amplifikation der V4-Region erfolgte gemäß dem zuvor beschriebenen EMP-Protokoll auf MiniSeq und für die V1–V2-Region haben wir Illumina MiniSeq-Durchflusszelladapter und -Indizes zu den zuvor beschriebenen Primern hinzugefügt. Die Sequenzen und Details der verwendeten Primer wurden in OligoAlanyzer (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA) verarbeitet und sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Amplifikation beider variabler Regionen wurde in 50-µL-Reaktionen durchgeführt, die 20 µL Platin enthielten II Hot-Start PCR Master Mix (2X) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), 0,1–0,3 µmol L−1 Primer (siehe Tabelle 1) und 6 µL Vorlage. Das thermische Profil begann mit der anfänglichen Denaturierung bei 94 °C × 3 Minuten, gefolgt von 35 Denaturierungszyklen bei 94 °C × 45 Sekunden, Tempern bei 52 °C × 1 Minute und Verlängerung bei 72 °C × 1 Minute und 30 Sekunden und a letzte Verlängerung bei 72 °C für 10 Min. Für die PCR-Produktreinigung wurden SPRIselect-Perlen (Beckman Coulter, Kalifornien, USA) verwendet. Nach Überprüfung der Länge der PCR-Produkte im 5200 Fragment Analyzer-System (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornien, USA) und Bestimmung ihrer Konzentration mit dem Quantus Fluorometer (Promega, Madison, Wisconsin, USA) wurden die PCR-Produkte zu einem standardisierten Pool zusammengefasst Konzentration von 4 nM. Die gepoolte Bibliothek wurde vorbereitet und dem MiniSeq Mid Output Kit (2 × 150 Paired-End-Sequenzierung) auf dem MiniSeq-Sequenzer (Illumina, San Diego, Kalifornien, USA) unter Verwendung benutzerdefinierter Sequenzierungsprimer für V4 und V1–V2 unterzogen (siehe Tabelle 1). .

Negativkontrollen bestanden aus reinen Reagenzkontrollen, bestehend aus leeren Sammelröhrchen, denen die gesamte DNA-Extraktion, PCR und Bibliotheksvorbereitung hinzugefügt wurde. Für jede Analyseplatte mit variablen Regionen waren drei Reagenzienkontrollen enthalten.

Rohe Fastq-Reads wurden mithilfe des Rbowtie2-Pakets (Version 1.14.0)37 auf das menschliche Genom hg38 abgebildet. Erfolgreich zugeordnete Lesevorgänge wurden dann vom Datensatz abgezogen. Der Rest der Lesevorgänge wurde mit dem DADA238-Paket (Version 1.20.0) in R (Version 4.1.1) verarbeitet. Die Analyse wurde gemäß der Standardarbeitsanweisung unter Hinzufügung der Leseverkettung durchgeführt. Kurz gesagt, die Lesevorgänge wurden zunächst gefiltert und gekürzt (maximal 0 mehrdeutige Basen, erwarteter Fehlerschwellenwert 2 und die letzten 10 Basen gekürzt). Gefilterte Lesevorgänge wurden dann derepliziert (eindeutige Sequenzen wurden extrahiert) und entrauscht (identifizierte Sequenzierungsfehler wurden mithilfe erlernter Fehlerraten und Qualitätsprofile der Lesevorgänge entfernt). Überlappende Lesevorgänge wurden zusammengeführt und nicht überlappende Lesevorgänge wurden verkettet. Anschließend wurden die Chimären entfernt und die Taxonomie mithilfe der RDP-naiven Bayesianischen Klassifikatormethode39 anhand der SILVA-Referenzdatenbank40 (Version 138.1) zugeordnet. Die Identifizierung und Entfernung kontaminierender DNA-Sequenzen erfolgte durch das R-Paket decontam41 unter Verwendung weithin reproduzierter Signaturen kontaminierender DNA (Ergänzungstabelle S1). Ein phylogenetischer Baum wurde mit dem Paket phangorn42 (Version 2.7.1) erstellt, wobei das Paket DECIPHER (Version 2.20.0) für mehrere Alignments verwendet wurde. Die Pakete Phyloseq43 (Version 1.36.0), Vegan44 (Version 2.6.2), Microbiome45 (Version 1.14.0), MicrobiotaProcess46 (Version 1.4.4) und DESeq247 (Version 1.32.0) wurden für nachfolgende phylogenetische und statistische Analysen verwendet. und die Pakete ggplot2, ggtree48 (Version 3.0.4) und patchwork49 (1.1.1) wurden zur Erstellung grafischer Ausgaben verwendet.

Während der aktuellen Studie generierte und analysierte Datensätze sind im SRA unter den BioProject-IDs PRJNA877810 und PRJNA995527 verfügbar. Die zur Analyse der Daten verwendeten DADA2-Codes finden Sie im Zusatzmaterial.

Gilbert, J. et al. Aktuelles Verständnis des menschlichen Mikrobioms. Nat. Med. 24, 392–400 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Berg, G. et al. Neuauflage der Mikrobiom-Definition: Alte Konzepte und neue Herausforderungen. Mikrobiom 8, 103 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Frankreich, MT et al. Einblick in die Ökologie vaginaler Bakterien durch integrative Analysen metagenomischer und metatranskriptomischer Daten. Genombiol. 23, 66 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pereira-Marques, J. et al. Einfluss der Wirts-DNA und der Sequenzierungstiefe auf die taxonomische Auflösung der gesamten Metagenomsequenzierung für die Mikrobiomanalyse. Vorderseite. Mikrobiol. 10, 1277 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Y.-X. et al. Ein praktischer Leitfaden zur Amplikon- und metagenomischen Analyse von Mikrobiomdaten. Proteinzelle 12, 315–330 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Johnson, JS et al. Auswertung der 16S-rRNA-Gensequenzierung für die Mikrobiomanalyse auf Arten- und Stammebene. Nat. Komm. 10, 5029 (2019).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thompson, LR et al. Ein gemeinschaftlicher Katalog enthüllt die multiskalige mikrobielle Vielfalt der Erde. Natur 551, 457–463 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Elliott, DRF, Walker, AW, O'Donovan, M., Parkhill, J. & Fitzgerald, RC Ein nicht-endoskopisches Gerät zur Probenahme der Mikrobiota der Speiseröhre: Eine Fall-Kontroll-Studie. Lanzette Gastroenterol. Hepatol. 2, 32–42 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Klindworth, A. et al. Evaluierung allgemeiner 16S-ribosomaler RNA-Gen-PCR-Primer für klassische und sequenzierungsbasierte Diversitätsstudien der nächsten Generation. Nukleinsäuren Res. 41, e1 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kameoka, S. et al. Benchmark der 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung unter Verwendung japanischer Darmmikrobiomdaten aus den Primersätzen V1–V2 und V3–V4. BMC-Genom. 22, 527 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Heidrich, V. et al. Die Wahl der 16S-ribosomalen RNA-Primer beeinflusst die Profilierung der männlichen Urinmikrobiota. Vorderseite. Zelle. Infizieren. Mikrobiol. 12, 862338 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Walker, SP et al. Die unspezifische Amplifikation menschlicher DNA ist eine große Herausforderung für die 16S-rRNA-Gensequenzanalyse. Wissenschaft. Rep. 10, 16356 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dacey, DP & Chain, FJJ Die Verkettung von Paired-End-Reads verbessert die taxonomische Klassifizierung von Amplicons zur Profilierung mikrobieller Gemeinschaften. BMC Bioinform. 22, 493 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Pichler, M. et al. Ein 16S-rRNA-Gensequenzierungs- und Analyseprotokoll für die Illumina MiniSeq-Plattform. MikrobiologieOpen 7, e00611 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Dessel, N., Swofford, CA & Forbes, NS Wirksam und tumorspezifisch: Bakterien mit therapeutischen Proteinen bewaffnen. Dort. Lieferung 6, 385–399 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

McAllister, SM et al. Biodiversität und neue Biogeographie der neutrophilen eisenoxidierenden Zetaproteobakterien ▿. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 77, 5445–5457 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Browne, HP et al. Die Kultivierung „nicht kultivierbarer“ menschlicher Mikrobiota bringt neuartige Taxa und ausgedehnte Sporulation zum Vorschein. Natur 533, 543–546 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rajilic-Stojanovic, M. et al. Systematische Übersicht: Magenmikrobiota in Gesundheit und Krankheit. Nahrung. Pharmakol. Dort. 51, 582–602 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Di Pilato, V. et al. Die Mikrobiota der Speiseröhre in Gesundheit und Krankheit. Ann. NY Acad. Wissenschaft. 1381, 21–33 (2016).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Bik, EM et al. Molekulare Analyse der bakteriellen Mikrobiota im menschlichen Magen. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 103, 732–737 (2006).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ruan, W., Engevik, MA, Spinler, JK & Versalovic, J. Gesundes menschliches Magen-Darm-Mikrobiom: Zusammensetzung und Funktion nach einem Jahrzehnt der Erforschung. Graben. Dis. Wissenschaft. 65, 695–705 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rajilić-Stojanović, M. & de Vos, WM Die ersten 1000 kultivierten Arten der menschlichen Magen-Darm-Mikrobiota. FEMS Mikrobiol. Rev. 38, 996–1047 (2014).

Artikel PubMed Google Scholar

Snider, EJ et al. Veränderungen des Mikrobioms der Speiseröhre im Zusammenhang mit der Progression vom Barrett-Ösophagus zum Adenokarzinom der Speiseröhre. Krebs-Epidemiol. Biomark. Vorher. 28, 1687–1693 (2019).

Artikel Google Scholar

Laserna-Mendieta, EJ et al. Ösophagus-Mikrobiom bei aktiver eosinophiler Ösophagitis und Veränderungen durch verschiedene Therapien. Wissenschaft. Rep. 11, 7113 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lopetuso, LR et al. Signatur des Ösophagus-Mikrobioms bei Patienten mit Barrett-Ösophagus und Ösophagus-Adenokarzinom. PLoS ONE 15, e0231789 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, D. et al. Charakterisierung der Mikrobiota der Speiseröhre und Vorhersage der Stoffwechselwege, die an Speiseröhrenkrebs beteiligt sind. Vorderseite. Zelle. Infizieren. Mikrobiol. 10, (2020).

Lv, J. et al. Veränderung der Mikrobiota der Speiseröhre bei Barrett-Ösophagus und Adenokarzinom der Speiseröhre. Welt J. Gastroenterol. 25, 2149–2161 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Z.-K. & Yang, Y.-S. Mikrobiota des oberen Gastrointestinaltrakts und Verdauungskrankheiten. Welt J. Gastroenterol. WJG 19, 1541–1550 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Derakshani, M., Lukow, T. & Liesack, W. Neuartige bakterielle Abstammungslinien auf der (Unter-)Divisionsebene, nachgewiesen durch charakteristische Nukleotid-gezielte Gewinnung von 16S-rRNA-Genen aus Massenerde und Reiswurzeln überfluteter Reismikrokosmen. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 67, 623–631 (2001).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Frock, AD, Gray, SR & Kelly, RM Hyperthermophile Thermotoga-Arten unterscheiden sich hinsichtlich spezifischer Kohlenhydrattransporter und Glykosidhydrolasen. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 78, 1978–1986 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Katayama, T. et al. Die Isolierung eines Mitglieds des Kandidatenstamms „Atribacteria“ enthüllt eine einzigartige Zellmembranstruktur. Nat. Komm. 11, 6381 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fadeev, E. et al. Vergleich zweier 16S-rRNA-Primer (V3–V4 und V4–V5) für Studien arktischer Mikrobengemeinschaften. Vorderseite. Mikrobiol. 12, (2021).

Sirichoat, A. et al. Vergleich verschiedener hypervariabler Regionen der 16S-rRNA zur taxonomischen Profilierung vaginaler Mikrobiota mittels Next-Generation-Sequenzierung. Bogen. Mikrobiol. 203, 1159–1166 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rintala, A. et al. Die Ergebnisse der Darmmikrobiota-Analyse hängen stark von der Zielregion des 16S-rRNA-Gens ab, wohingegen der Einfluss der DNA-Extraktion gering ist. J. Biomol. Technik. JBT 28, 19–30 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Zheng, W. et al. Ein genauer und effizienter experimenteller Ansatz zur Charakterisierung der komplexen oralen Mikrobiota. Mikrobiom 3, 48 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Walters, W. et al. Verbesserte bakterielle 16S-rRNA-Gene (V4 und V4–5) und pilzinterne transkribierte Spacer-Marker-Gen-Primer für mikrobielle Gemeinschaftsuntersuchungen. mSystems 1, e00009-15 (2015).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Wei, Z., Zhang, W., Fang, H., Li, Y. & Wang, X. esATAC: Eine benutzerfreundliche systematische Pipeline für die ATAC-seq-Datenanalyse. Bioinformatik 34, 2664–2665 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Callahan, BJ et al. DADA2: Hochauflösende Probeninferenz aus Illumina-Amplikondaten. Nat. Methoden 13, 581–583 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Q., Garrity, GM, Tiedje, JM & Cole, JR Naiver Bayesianischer Klassifikator für die schnelle Zuordnung von rRNA-Sequenzen in die neue Bakterientaxonomie. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 73, 5261–5267 (2007).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Quast, C. et al. Das SILVA-Ribosomal-RNA-Gendatenbankprojekt: Verbesserte Datenverarbeitung und webbasierte Tools. Nukleinsäuren Res. 41, D590-596 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Davis, NM, Proctor, DM, Holmes, SP, Relman, DA & Callahan, BJ Einfache statistische Identifizierung und Entfernung kontaminierender Sequenzen in Markergen- und Metagenomikdaten. Mikrobiom 6, 226 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Schliep, KP phangorn: Phylogenetische Analyse in R. Bioinform. Oxf. Engl. 27, 592–593 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

McMurdie, PJ & Holmes, S. phyloseq: Ein R-Paket für reproduzierbare interaktive Analysen und Grafiken von Mikrobiom-Volkszählungsdaten. PLoS ONE 8, e61217 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dixon, P. VEGAN, ein Paket von R-Funktionen für die Gemeinschaftsökologie. J. Veg. Wissenschaft. 14, 927–930 (2003).

Artikel Google Scholar

Lahti, L. & Shetty, S. Mikrobiom: Mikrobiomanalyse. (2022) https://doi.org/10.18129/B9.bioc.microbiome.

Xu, S. & Yu, G. MicrobiotaProcess: Ein umfassendes R-Paket zur Verwaltung und Analyse von Mikrobiom- und anderen ökologischen Daten innerhalb des aufgeräumten Rahmens. R-Paketversion. (2022).

Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Moderierte Schätzung der Faltungsänderung und Streuung für RNA-seq-Daten mit DESeq2. Genombiol. 15, 550 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, G. Verwendung von ggtree zur Visualisierung von Daten zu baumähnlichen Strukturen. Curr. Protokoll. Bioinforma. 69, e96 (2020).

Artikel Google Scholar

Pedersen, TL-Patchwork. (2022).

Referenzen herunterladen

Diese Studie wurde vom Gesundheitsministerium der Tschechischen Republik gefördert, Fördernr. NU20-03-00126 und vom Gesundheitsministerium der Tschechischen Republik – konzeptionelle Entwicklung einer Forschungsorganisation (FNBr, 65269705, Sup 3/21). Die Rechenressourcen wurden vom Projekt „e-Infrastruktura CZ“ (e-INFRA CZ LM2018140) bereitgestellt, das vom Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik unterstützt wird. Diese Arbeit wurde mit Unterstützung der RECETOX Research Infrastructure (ID LM2018121, MEYS CR, 2020-2022) und dem vom Bildungsministerium finanzierten Projekt CETOCOEN EXCELLENCE (Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/17_043/0009632) durchgeführt , Jugend und Sport zur Infrastrukturunterstützung. Wir danken der CF Genomics CEITEC MU, die von der NCMG-Forschungsinfrastruktur (LM2018132 finanziert von MEYS CR) unterstützt wird, für ihre Unterstützung bei der Beschaffung der in diesem Dokument vorgestellten wissenschaftlichen Daten. Diese Arbeit wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm „Horizont 2020“ der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 857560 gefördert. Diese Veröffentlichung gibt nur die Meinung der Autoren wieder und die Europäische Kommission übernimmt keine Verantwortung für die Verwendung der darin enthaltenen Informationen.

Abteilung für Biochemie, Fakultät für Naturwissenschaften, Masaryk-Universität, Kamenice 735/5, 62500, Brünn, Tschechische Republik

Tereza Deissová, Martina Zapletalová und Jan Lochman

Abteilung für Gastroenterologie und Innere Medizin, Universitätsklinikum Brünn, und Medizinische Fakultät, Masaryk-Universität, Jihlavská 20, 62500, Brünn, Tschechische Republik

Lumir Kunovský, Radek Kroupa & Tomáš Grolich

Abteilung für Chirurgie, Universitätsklinikum Brünn, und Medizinische Fakultät, Masaryk-Universität, Jihlavská 20, 62500, Brünn, Tschechische Republik

Lumir Kunovský & Zdeněk Kala

Abteilung für Pathophysiologie, Medizinische Fakultät, Masaryk-Universität, Jihlavská 20, 62500, Brünn, Tschechische Republik

Petra Bořilová Linhartová & Jan Lochman

Fakultät für Naturwissenschaften, RECETOX, Masaryk-Universität, Kotlářská 2, Brünn, Tschechische Republik

Petra Borilová Linhartová

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Konzeptualisierung, JL und PBL; Sequenz- und statistische Datenanalyse, MZ und TD; Finanzierungseinwerbung, PBL, ZK; Untersuchung, JL, MZ, PBL, TD und ZK; klinische Untersuchung und Probenentnahme, LK und RK; Supervision, JL und PBL; Schreiben – Originalentwurf, JL und TD; Rezension und Bearbeitung, alle Mitautoren. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Jan Lochman.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Deissová, T., Zapletalová, M., Kunovský, L. et al. Die Wahl des 16S-rRNA-Genprimers beeinflusst die Off-Target-Amplifikation bei Biopsien des menschlichen Gastrointestinaltrakts und bei der Mikrobiomprofilierung. Sci Rep 13, 12577 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39575-8

Zitat herunterladen

Eingegangen: 24. März 2023

Angenommen: 27. Juli 2023

Veröffentlicht: 03. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39575-8

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.