Synergie- und Sauerstoffanpassung für die Entwicklung von Next

Natur (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die menschliche Darmmikrobiota hat als Umweltfaktor, der zu Gesundheit oder Krankheit beitragen kann, an Bedeutung gewonnen1. Die Entwicklung von Probiotika der nächsten Generation ist eine vielversprechende Strategie zur Modulation der Darmmikrobiota und zur Verbesserung der menschlichen Gesundheit; Einige wichtige Kandidaten für Probiotika der nächsten Generation sind jedoch streng anaerob2 und erfordern möglicherweise eine Synergie mit anderen Bakterien für ein optimales Wachstum. Faecalibacterium prausnitzii ist ein weit verbreitetes und häufig vorkommendes menschliches Darmbakterium, das mit der menschlichen Gesundheit in Zusammenhang steht, aber noch nicht für probiotische Formulierungen entwickelt wurde2. Hier beschreiben wir die Co-Isolierung von F. prausnitzii und Desulfovibrio piger, einem sulfatreduzierenden Bakterium, und deren Kreuzfütterung für Wachstum und Butyratproduktion. Um eine probiotische Formulierung der nächsten Generation herzustellen, haben wir F. prausnitzii an die Toleranz gegenüber Sauerstoffexposition angepasst und in Proof-of-Concept-Studien gezeigt, dass das symbiotische Produkt von Mäusen und Menschen vertragen wird (ClinicalTrials.gov-Kennung: NCT03728868) und wird im menschlichen Darm bei einer Untergruppe der Studienteilnehmer nachgewiesen. Unsere Studie beschreibt eine Technologie zur Herstellung von Probiotika der nächsten Generation, die auf der Anpassung streng anaerober Bakterien an die Toleranz gegenüber Sauerstoffexposition basiert, ohne dass die potenziellen positiven Eigenschaften beeinträchtigt werden. Unsere Technologie kann für die Entwicklung anderer streng anaerober Stämme als Probiotika der nächsten Generation genutzt werden.

Die Darmmikrobiota eines erwachsenen Menschen besteht aus mindestens so vielen Bakterienzellen wie unsere Gesamtzahl an Körper- und Keimzellen3 und ihr kollektives Genom (Mikrobiom) enthält mehr als 500-mal mehr Gene als unser menschliches Genom4. Vergleichende Metagenomikstudien haben gezeigt, dass ein gesundes Mikrobiom im Vergleich zum Mikrobiom von Patienten mit Typ-2-Diabetes5,6,7, Hyperlipidämie8 und entzündlichen Darmerkrankungen9,10 häufig mit einer erhöhten mikrobiellen Vielfalt und einer erhöhten Häufigkeit von Butyrat-produzierenden Bakterien einhergeht. wie Faecalibacterium prausnitzii. Insbesondere F. prausnitzii ist eine Schlüsselart, deren Häufigkeit je nach Alter und Lebensstil variiert und die in der Darmmikrobiota von Menschen in der westlichen Welt relativ selten vorkommt11.

Menschliche Darmmikroorganismen agieren nicht isoliert, sondern gehen komplexe ökologische Interaktionen ein, die für die Darmhomöostase wichtig sind. Eine Schlüsseleigenschaft der Darmmikrobiota ist die Fermentation von Kohlenhydraten zu kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs), einschließlich Butyrat, die mit mehreren Vorteilen für den Wirt verbunden ist12. Die Fermentation ist der wichtigste Energieerzeugungsprozess, der von Darmmikroorganismen genutzt wird, und die Entfernung von Elektronensenkennebenprodukten der Fermentation wie Laktat und Wasserstoff ist für die Aufrechterhaltung fermentativer Prozesse unerlässlich13. Dementsprechend sind Wasserstofffänger wie Methanogene und sulfatreduzierende Bakterien wichtig für den Aufbau von Stoffwechselnetzwerken im Darm14.

Hier berichten wir über die Isolierung eines neuen Stammes von F. prausnitzii in Co-Kultur mit einem neuen Stamm des Sulfatreduzierers Desulfovibrio piger. Wir beschreiben die Entwicklung einer Technologie zur Produktion von F. prausnitzii als Probiotikum der nächsten Generation und bewerten seine Sicherheit für den menschlichen Verzehr.

Um die Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen zu bewahren und Bakterien zu isolieren, die als Elektronensenke dienen und Laktat entfernen können, haben wir Fäkalienmaterial einer gesunden Person unter anaeroben Bedingungen direkt auf Agarplatten mit Postgate-Medium (PGM) ausplattiert (Methoden). Unter diesen Bedingungen isolierten wir einen Stamm von F. prausnitzii (DSM32186), der in PGM als Co-Kultur mit einem Stamm von D. piger (DSM 32187) wuchs (Abb. 1a, b). D. piger sind obligat anaerobe, nicht fermentierende, gramnegative Bakterien15 und im menschlichen Darm vorherrschende Sulfatreduzierer16, kommen außerhalb des Darms nicht isoliert vor und gelten daher als darmspezifische Kommensalen17.

a, Co-Kultur von F. prausnitzii DSM 32186 und D. piger DSM 32187 auf PGM-Platten ohne Zusatz von Glucose oder Acetat. b, Gramfärbung von Kolonien aus der Isolierung von F. prausnitzii DSM 32186 und D. piger DSM 32187. Pfeile zeigen F. prausnitzii (lange spindelförmige Stäbchen) (1) und D. piger (kurze Stäbchen) (2). Maßstabsbalken, 10 μm. c, Dendrogramm, das die Beziehung zwischen D. piger DSM 32187 und verwandten Genomen veranschaulicht. d, Dendrogramm, das die Beziehung zwischen F. prausnitzii DSM 32186 und verwandten Genomen veranschaulicht. e, Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten von F. prausnitzii DSM 32186 in Monokultur und in Co-Kultur mit D. piger DSM 32187 unter anaeroben Bedingungen in mPGM (PGM mit 25 mM Glucose) für 24 Stunden. P = 0,0003. f, Metabolitenprofile von F. prausnitzii DSM 32186 und D. piger DSM 32187, kultiviert als Monokulturen oder Co-Kultur unter anaeroben Bedingungen in mPGM-Medium für 24 Stunden. Glukose: P = 0,0000031 (F. prausnitzii + D. piger gegenüber D. piger), P = 0,0000038 (F. prausnitzii + D. piger gegenüber F. prausnitzii); Laktat: P = 0,0000001 (F. prausnitzii + D. piger gegenüber D. piger), P = 0,0000005 (F. prausnitzii gegenüber D. piger), P = 0,00014 (F. prausnitzii + D. piger gegenüber F. prausnitzii); Acetat: P = 0,0000004 (F. prausnitzii + D. piger gegenüber D. piger), P = 0,0000003 (F. prausnitzii gegenüber D. piger); Butyrat: P = 0,000001 (F. prausnitzii + D. piger gegenüber D. piger), P = 0,0000031 (F. prausnitzii + D. piger gegenüber F. prausnitzii). „mM-Änderung“ auf der Y-Achse gibt den Konzentrationsunterschied zum beimpften Medium zu Beginn an. g, Schematische Darstellung der vorgeschlagenen Kreuzfütterung zwischen F. prausnitzii und D. piger als Co-Kultur in mPGM. n = 3 unabhängige Experimente, ***P < 0,001 bestimmt durch zweiseitigen t-Test (e) oder einfaktorielle ANOVA (f). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM

Um die Identität der Isolate zu bestätigen, sequenzierten wir ihre Genome und beobachteten, dass sich D. piger DSM 32187 mit anderen sequenzierten D. piger-Stämmen gruppierte (Abb. 1c), wohingegen F. prausnitzii DSM 32186 mit der Phylogruppe II von F. prausnitzii gruppierte. einschließlich Stamm A2-165 (Abb. 1d). Die Genomanalysen zeigten, dass beide Isolate spezifische Kladen im Stammbaum bildeten, was darauf hindeutet, dass es sich um zuvor nicht charakterisierte Stämme handelte. Da A2-165 entzündungshemmende Eigenschaften hat18 und an der Schleimhautschnittstelle interagieren kann19, haben wir das probiotische Potenzial von DSM 32186 überprüft, indem wir seine immunmodulatorischen Eigenschaften im Vergleich zu A2-165 bewertet haben. Wir beobachteten ähnliche Verringerungen der durch Interleukin-1β (IL-1β) induzierten Sekretion von IL-8, als Überstände aus den verschiedenen F. prausnitzii-Stämmen auf Caco-2-Zellen aufgetragen wurden (Extended Data Abb. 1), was die Verwandtschaft mit A2 bestätigte. 165 auf phänotypischer Ebene.

Wir stellten die Hypothese auf, dass die gemeinsame Isolierung von F. prausnitzii und D. piger in PGM und ihre mutmaßliche symbiotische Beziehung auf komplementäre Stoffwechselanforderungen zurückzuführen sind. Um diese Hypothese zu verifizieren, kultivierten wir die beiden Stämme gemeinsam in einem modifizierten PGM-Medium, das Glucose zur Unterstützung von F. prausnitzii enthielt, und beobachteten, dass das Wachstum von F. prausnitzii in der Kokultur im Vergleich zur Monokultur im gleichen Medium deutlich zunahm ( Abb. 1e). Die Analyse der Metaboliten in konditioniertem Medium nach 24-stündigem Wachstum ergab, dass Monokulturen von D. piger erwartungsgemäß Laktat verbrauchten und Acetat produzierten, ohne Glukose zu verbrauchen, wohingegen Monokulturen von F. prausnitzii sehr geringe Mengen Laktat produzierten (Abb. 1f). Co-Kulturen von F. prausnitzii mit D. piger förderten jedoch die Fermentation von Glucose und die Produktion von Lactat und Butyrat (Abb. 1f). F. prausnitzii produziert Butyrat über den Butyryl-Coenzym A (CoA): Acetat-CoA-Transferase-Weg und dementsprechend reichert sich Acetat in Co-Kulturen nicht im Medium an (Abb. 1f), da Acetat für die Butyratproduktion erforderlich ist20,21. Unsere Ergebnisse legen daher nahe, dass D. piger in der Co-Kultur in PGM als Elektronensenke fungierte, da es Laktat verbrauchte; D. piger erzeugte Acetat, das von F. prausnitzii für das Wachstum und die Butyratproduktion verwendet wurde (Abb. 1g).

Die Produktentwicklung für Probiotika der nächsten Generation ist aufgrund der Sauerstoffempfindlichkeit menschlicher Darmbakterien eine Herausforderung. Dieser Prozess erfordert auch die Optimierung der Wachstumsbedingungen, um ausreichende Biomasseerträge zu erzielen, sowie neuartige Strategien zur Erhaltung der Lebensfähigkeit des Endprodukts2. Wir verwendeten die Co-Kultur von F. prausnitzii mit D. piger, um die Wachstumsausbeute bei Fermentationen zu steigern, wie in Abb. 1e gezeigt. Da F. prausnitzii jedoch äußerst empfindlich gegenüber Sauerstoff in der Umgebungsluft ist21, wurden keine Kolonien gewonnen, als F. prausnitzii DSM 32186 20 Minuten lang der Luft ausgesetzt war (Abb. 2a). Im Gegensatz dazu ist D. piger unter den gleichen Bedingungen relativ sauerstofftolerant (Extended Data Abb. 2).

a, Sauerstofftoleranz von F. prausnitzii DSM 32186 in YCFAG-Medium nach 20-minütiger Exposition gegenüber Umgebungsluft im Vergleich zu in Anaerobiose inkubierten Kontrollplatten. b, Schematische Darstellung des modifizierten simulierten menschlichen Redox-Darm-Modells (m-SHIRM)-Bioreaktors. c, Die oxidative Anpassungsstrategie zur Entwicklung sauerstofftoleranter Stämme von F. prausnitzii. d, Sauerstofftoleranz des sauerstoffangepassten F. prausnitzii DSM 32379, entwickelt aus dem Elternstamm DSM 32186. Sauerstoffexposition durchgeführt wie in Abb. 2a. Die Zahlen rechts neben den Agarplatten in a,d geben die Verdünnung an.

Wie zuvor gezeigt, kann die Haltbarkeitsdauer von Formulierungen, die F. prausnitzii enthalten, durch die Verwendung von Antioxidantien wie Cystein verlängert werden, allerdings mit begrenzter Anwendbarkeit für die Produktion im industriellen Maßstab, da die Lebensfähigkeit nach 24-stündiger Einwirkung von Umgebungsluft verloren geht22. Um die Sauerstofftoleranz von F. prausnitzii zu verbessern, verwendeten wir eine Anpassungsstrategie unter Verwendung eines m-SHIRM-Bioreaktors23, in dem DSM 32186 zehn aufeinanderfolgende Subkulturschritte lang oxidierten Bedingungen mit abnehmenden Cysteinkonzentrationen und zunehmendem anodischem Potenzial ausgesetzt wurde (Abb. 2b, c). . Bei jedem Schritt wurde eine Probe aus dem vorherigen Schritt anaerob auf das Wachstumsmedium Hefeextrakt-Casitonfettsäure-Glukose (YCFAG) geimpft. Die visuelle Untersuchung der Platten ergab unterschiedliche Koloniemorphotypen in der sechsten und zehnten Subkultur (Extended Data Abb. 3), und fünf Koloniemorphotypen wurden zur Charakterisierung der Sauerstofftoleranz nach taxonomischer Bestätigung als F. prausnitzii durch 16S-rRNA-Gensequenzierung ausgewählt. Eine erhöhte Sauerstofftoleranz wurde eindeutig für zwei Morphotypen beobachtet (Extended Data Abb. 4a) – DSM 32378 (Extended Data Abb. 4b) und DSM 32379 (Abb. 2d) – und trat ohne Verlust der Butyratproduktionskapazität auf (Extended Data Abb. 4c). ). DSM 32379 wies den höchsten Anstieg der Sauerstofftoleranz auf (Extended Data Abb. 4a) und wurde daher weiterhin für die Analyse des synergistischen Wachstums mit D. piger DSM 32187 ausgewählt, das ebenfalls nicht betroffen war (Extended Data Abb. 5).

Aufgrund der Sauerstofftoleranz und der Kokultur mit D. piger konnten wir daher F. prausnitzii in ausreichenden Mengen für die Verabreichung an Menschen produzieren: Das sauerstofftolerante DSM 32379 konnte gefriergetrocknet werden und hielt die 2 Wochen ein ausreichende Stabilitätskriterien bei –20 °C, um zu Kapseln mit begrenztem Verlust der Lebensfähigkeit entwickelt zu werden (log10(koloniebildende Einheiten (KBE) g−1) = 9,6 gegenüber 9,5 vor bzw. nach zweiwöchiger Lagerung). Im Gegensatz dazu lieferte der Elternstamm DSM 32186 eine geringere Biomasse (log10(CFU g−1) = 8,5) und erlitt einen Verlust der Lebensfähigkeit von 97 %.

Um mögliche molekulare Mechanismen zu beschreiben, die zu einer erhöhten Sauerstofftoleranz führen, führten wir eine Genomsequenzierung von DSM 32379 durch, die 15 Varianten in 10 Loci ergab, die 23 Nukleotide (0,0007 % des Gesamtgenoms) betreffen. Diese Varianten traten in Genen mit bekannten und unbekannten Funktionen auf (erweiterte Datentabelle 1), aber da wir DSM 32186 mithilfe molekularbiologischer Ansätze nicht genetisch modifizieren konnten, konnten wir ihre Rolle bei der Entwicklung der Sauerstofftoleranz nicht überprüfen und daher bleiben die molekularen Mechanismen unbekannt . Die Sauerstofftoleranz in DSM 32379 veränderte jedoch nicht die immunmodulatorischen Eigenschaften (Extended Data Abb. 1) und DSM 32379 behielt die Fähigkeit, einen Riboflavin-abhängigen extrazellulären Elektronenshuttle zu nutzen (Extended Data Abb. 6), den wir zuvor in F. charakterisiert hatten. prausnitzii A2-165 (Lit. 19). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Sauerstofftoleranz in DSM 32379 die Zellphysiologie, den Stoffwechsel und das Potenzial zur Interaktion mit dem Wirt an der Schleimhautschnittstelle nicht verändert, und diese Variante wurde für die Herstellung eines Prüfprodukts ausgewählt.

Als nächstes bewerteten wir die Sicherheit des kombinierten Produkts, indem wir männlichen und weiblichen Swiss Webster-Mäusen eine Bakteriensuspension mit F. prausnitzii DSM 32379 und D. piger DSM 32187 per Sonde verabreichten. Die Mäuse erhielten fünfmal in der ersten Woche 1010 KBE pro Stamm und Dosis und dann 3 Wochen lang zweimal pro Woche, und wir beobachteten keine unerwünschten Reaktionen. Die Blinddarmkonzentrationen von F. prausnitzii und D. piger wurden mittels quantitativer PCR (qPCR) bestimmt, wir konnten jedoch am Ende der Studie bei keiner der beiden Arten erhöhte Konzentrationen beobachten, was möglicherweise auf die Art und Häufigkeit der Verabreichung und die Lokalisation im Dickdarm zurückzuführen ist von F. prausnitzii und/oder Wirtsspezifität.

Um die Verträglichkeit der Bakterien zu untersuchen, haben wir 50 gesunde Männer und Frauen im Alter von 20–40 Jahren für eine randomisierte, placebokontrollierte Studie zur Ergänzung mit niedrigen (1 × 108–5 × 108 KBE pro Kapsel) oder hohen (1 × 109–5) rekrutiert × 109 KBE pro Kapsel) Dosen von F. prausnitzii DSM 32379 und D. piger für 8 Wochen im Vergleich zu Placebo (Ergänzungstabelle 1). Die klinischen Merkmale der Gruppen waren identisch, mit Ausnahme des Alters (höher in der Gruppe mit niedriger Dosis im Vergleich zu Placebo), der Alanin-Transaminase-Werte (niedriger in der Gruppe mit niedriger Dosis im Vergleich zu Placebo) und der Werte der alkalischen Phosphatase (niedriger in der Gruppe mit hoher Dosis). Gruppe im Vergleich zu Placebo). Das Prüfpräparat wurde unabhängig von der Dosis gut vertragen. Kein Studienteilnehmer brach die Studie aufgrund eines unerwünschten Ereignisses ab (Ergänzungstabelle 2) und es gab keine erhöhte Häufigkeit unerwünschter Ereignisse oder gastrointestinaler Symptome in den Behandlungsgruppen (Ergänzungstabellen 3 und 4). Es gab keine klinisch relevanten oder statistisch signifikanten Gruppen-zu-Gruppen-Unterschiede in der Veränderung zwischen dem Ausgangswert und acht Wochen bei irgendwelchen sekundären Endpunkten der Blutbiochemie (einschließlich Nierenfunktion, Blutzellzahl, Leberenzyme, Entzündungsmarker, Hämoglobin, glykosyliertes Hämoglobin oder Fasten). Blutzucker; Ergänzungstabellen 5 und 6).

Wir führten eine metagenomische Sequenzierung des gesamten Genoms durch, um mögliche Auswirkungen auf die menschliche Darmmikrobiota zu bewerten. Es gab keine Unterschiede zwischen den Gruppen in der Gesamtzusammensetzung zu Studienbeginn oder am Ende der Verabreichung (Erweiterte Daten, Abb. 7a, b), und in keiner der Gruppen wurde eine Veränderung im Vergleich zum Ausgangswert beobachtet (Erweiterte Daten, Abb. 7c). –e). Allerdings erhöhte sich die Anzahl der auf Artenebene ermittelten Sequenzierungsablesungen für D. piger bei den Teilnehmern, die die hohe Dosis erhielten (P < 0,01) (Abb. 3a), wohingegen sich die Anzahl der Sequenzierungsablesungen für F. prausnitzii auf Artenebene nicht änderte (Abb. 3b). ). Wir nutzten die Genomerfassung zur spezifischen Quantifizierung der Stämme und stellten fest, dass sowohl der Elternstamm F. prausnitzii DSM 32186 als auch der D. piger DSM 32187 zu Studienbeginn eine hohe Prävalenz aufwiesen (43 von 43 bzw. 35 von 43). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen auf Artenebene stiegen die Anteile von D. piger DSM 32187 in der Hochdosisgruppe (P = 0,051; Abb. 3c) und insbesondere in denjenigen mit geringer relativer Häufigkeit zu Studienbeginn (weniger als 0,05 %). P = 0,042; Erweiterte Daten Abb. 8), obwohl sie innerhalb des Bereichs blieben, der für die Placebogruppe (Abb. 3c) und für gesunde Schweden beobachtet wurde, bei denen innerhalb eines Jahres mehrmals Proben genommen wurden16. Wir fanden auch heraus, dass sich die Anteile von F. prausnitzii DSM 32186 nicht veränderten (Abb. 3d). In Übereinstimmung mit dem Fehlen von Verschiebungen in der Zusammensetzung änderten sich die Konzentrationen der fäkalen SCFAs nicht (Ergänzungstabelle 7) und – trotz des Anstiegs bei D. piger – gab es keine Veränderung der fäkalen Schwefelwasserstoffkonzentrationen (Erweiterte Daten, Abb. 9). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass unsere probiotische Formulierung sowohl für den Wirt (d. h. es treten keine Nebenwirkungen und gastrointestinalen Symptome auf) als auch für die Darmmikrobiota (d. h. keine Veränderungen in der Zusammensetzung und im Stoffwechsel) sicher sind.

a,b, Gesamtfäkalienzahlen von D. piger (P = 0,033) (hohe Dosis) (a) und F. prausnitzii (b) in metagenomischen Daten vor und nach der Verabreichung des Prüfpräparats. c,d, Die relative Häufigkeit von D. piger DSM 32187 (c) und F. prausnitzii DSM 32186 (d) in metagenomischen Daten vor und nach der Verabreichung. n = 13 (Placebo), 16 (niedrige Dosis) und 14 (hohe Dosis); **P < 0,01, zweiseitiger Wilcoxon-Signed-Rank-Test. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM

Die Gesamthäufigkeit von F. prausnitzii auf Artenebene lag zwischen 3,4 und 25,9 % (Mittelwert 13,2 %), was dem Bereich ähnelte, der für gesunde Individuen ähnlichen Alters aus den USA sowie für ältere gesunde Individuen aus Schweden und dem Vereinigten Königreich beobachtet wurde16 und höher als die Häufigkeit auf Artenebene in einer kürzlich durchgeführten großen Metaanalyse mit 7.907 Kotmetagenomen11 (Mittelwert 6,5 ± 7,6 %). Daher wurde die weitere Zunahme von F. prausnitzii wahrscheinlich durch die Sättigung der Nische begrenzt. Da wir jedoch auf der Grundlage des Modells in Abb. 1g einen Anstieg für D. piger DSM 32187 beobachteten, vermuteten wir, dass es einen Effekt auf die Häufigkeit anderer Butyratproduzenten gab, beispielsweise derjenigen, die extrazelluläres Acetat für die Butyratproduktion benötigen ähnlich zu F. prausnitzii20. Wir quantifizierten terminale Gene für die Butyratproduktion und beobachteten eine signifikante positive Korrelation für die Veränderung des Butyratproduktionspotenzials und die Veränderung von D. piger DSM 32187 am Ende der Verabreichung im Vergleich zum Ausgangswert bei allen Personen (Spearman-Rho = 0,48, P = 0,001). ) und bei Personen, die eine niedrige oder hohe Dosis erhielten (Spearman-Rho = 0,49, P = 0,006), jedoch nicht in der Placebogruppe (Spearman-Rho = 0,39, P = 0,185). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit einer kürzlich durchgeführten Studie, die das gleichzeitige Auftreten von Desulfovibrio mit verschiedenen Butyratproduzenten wie Faecalibacterium, Roseburia, Oscillospira und Coprococcus24 zeigt, und legen nahe, dass unsere probiotische Formulierung das Gesamtpotenzial der Butyratproduktion in komplexen Gemeinschaften im menschlichen Darm unterstützen könnte . Diese Ergebnisse unterstreichen auch die potenzielle Bedeutung von Ausgangs- und/oder spezifischen Darmmikrobiota-Konfigurationen für mikrobiotabasierte Behandlungsstrategien25,26,27,28.

Schließlich haben wir versucht, F. prausnitzii DSM 32379 in Stuhlproben nachzuweisen. qPCR-Assays, die auf eine oder mehrere der genetischen Varianten abzielten, unterschieden nicht ausreichend und Genomerfassungsmethoden konnten nicht verwendet werden, um die sauerstofftolerante Variante DSM 32379 von der Elternvariante DSM 32186 zu unterscheiden, da diese Methoden eine Ähnlichkeit des gesamten Genoms von weniger als 96 % erfordern zur Identifizierung einzigartiger Stämme29, und DSM 32379 ist zu 99,9993 % mit DSM 32186 identisch. Daher stellen die durch Genomerfassung am Ende der Verabreichung nachgewiesenen Zahlen von F. prausnitzii DSM 32186 wahrscheinlich die Summe des endogenen DSM 32186 und der Sauerstoff- tolerantes DSM 32379, verabreicht mit der probiotischen Formulierung. Um das mögliche Vorhandensein von DSM 32379 in Stuhlproben zu verfolgen, haben wir die spezifischen genetischen Varianten in den metagenomischen Daten nachgewiesen (Methoden). Wir haben bei einigen Teilnehmern zu Studienbeginn oder in der Placebogruppe wenige Markervarianten (z. B. Variante 7) beobachtet, was mit der beobachteten genetischen Plastizität von F. prausnitzii10 übereinstimmt, und am Ende haben wir zusätzliche Varianten und/oder mehrere Kombinationen gefunden Verabreichung in einer Untergruppe der Studienteilnehmer in der Niedrigdosis- und Hochdosisgruppe (Ergänzungstabelle 8). Der geringe Nachweis von DSM 32379 in den fäkalen Metagenomen könnte auf die hohe genomische Identität zwischen DSM 32379 und dem Elternstamm und die daraus resultierende unzureichende Abdeckung in den metagenomischen Daten zurückzuführen sein und könnte durch die hohen Werte von DSM 32186 zu Studienbeginn beeinflusst werden, die auf eine Sättigung hinweisen Nische im Darmlumen. Da F. prausnitzii jedoch auch an der Schleimhautschnittstelle vorhanden ist19, spiegelt die Stuhlprobe möglicherweise nicht die Anzahl von DSM 32379 in der Nähe der Schleimhaut wider, wo das sauerstofftolerante DSM 32379 möglicherweise einen Wettbewerbsvorteil hat. Daher gehen wir davon aus, dass unser Probiotikum der nächsten Generation in der Lage sein könnte, F. prausnitzii bei Patientengruppen mit geringerer Häufigkeit dieses Bakteriums (z. B. Patienten mit Typ-2-Diabetes) und bei Personen mit Darmentzündungen (z. B. entzündlichen Darmerkrankungen) zu erhöhen. Dies wird durch die Beobachtung gestützt, dass die Verabreichung von F. prausnitzii A2-165 die Kolitis verbessert und die Mikrobiota bei Mäusen teilweise wiederherstellen kann9.

Unsere Studie weist einige Einschränkungen auf. Aufgrund begrenzter Längsschnittdaten haben wir keine vorübergehenden oder personalisierten Reaktionen der Darmmikrobiota auf die verabreichte Formulierung untersucht. Darüber hinaus konnten wir die molekularen Mechanismen, die zu einer erhöhten Sauerstofftoleranz bei F. prausnitzii führen, nicht bestimmen. Dennoch haben wir einen Ansatz entwickelt, der auf der in dieser Studie isolierten syntrophischen Interaktion zwischen F. prausnitzii und D. piger basiert und zu einem erhöhten Wachstum von F. prausnitzii und der Butyratproduktion in vitro führt und möglicherweise das Butyratproduktionspotenzial in vivo beim Menschen beeinflusst Darm.

Die gezielte Bekämpfung der Darmmikrobiota birgt ein großes Potenzial zur Verbesserung der menschlichen Gesundheit, und Metagenomikstudien der letzten zwei Jahrzehnte haben eine breite Palette von Bakterien identifiziert, die Kandidaten für die Entwicklung von Probiotika der nächsten Generation sein könnten2. Da es jedoch bei 70 % der in metagenomischen Untersuchungen entdeckten Bakterienarten keine kultivierten Vertreter gibt30, wurden in Humanstudien nur wenige potenzielle Kandidaten bewertet. Beispielsweise haben sich Akkermansia muciniphila31 und Anaerobutyricum soehngenii25 als einzelne Art oder in Kombination mit sporenbildenden Bakterien32 als sicher für den menschlichen Verzehr erwiesen und vorläufige Daten zeigen, dass sie positive Auswirkungen auf den Glukosestoffwechsel bei Mäusen und Menschen haben25,31,32.

Die größten Herausforderungen für die Entwicklung menschlicher Darmbakterien als Probiotika der nächsten Generation sind das anspruchsvolle Wachstum (d. h. der Bedarf an bestimmten Nährstoffen oder Bedingungen) und die Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff. Zu den Beispielen menschlicher Isolate, die bisher als Probiotika der nächsten Generation ausgewählt wurden, gehören tatsächlich Bacteroides- und Clostridium-Stämme2 (wie Bacteroides fragilis und Clostridium butyricum), die unter anaeroben Darmbakterien eine relativ hohe Sauerstofftoleranz aufweisen33,34. Darmbakterien mit inhärenter Sauerstofftoleranz können bei direkter Einwirkung von Sauerstoff eine erhöhte Sauerstofftoleranz entwickeln, wie Meehan et al. zeigten, die sauerstoffaktivierte Varianten von B. fragilis isolierten34. Auf extrem sauerstoffempfindliche Bakterien wie F. prausnitzii kann dieser Ansatz nicht angewendet werden, diese können jedoch mit dem hier beschriebenen Ansatz gezielt bekämpft werden.

Nach unserem Kenntnisstand wurden streng anaerobe Bakterien wie F. prausnitzii nicht in lebenden Formulierungen für den menschlichen Verzehr beschrieben. Da die Häufigkeit von F. prausnitzii bei Patienten mit Hyperlipidämie8, Prädiabetes und Typ-2-Diabetes5,6, nichtalkoholischer Fettlebererkrankung35 und entzündlicher Darmerkrankung9 verringert ist, ist die Produktion von F. prausnitzii als Probiotikum der nächsten Generation von großem Interesse. Unsere Strategie, die auf der Nutzung bestehender Synergien zwischen Darmmikroorganismen und einer verbesserten Sauerstofftoleranz basiert, zeigt, wie F. prausnitzii als Probiotikum der nächsten Generation für den menschlichen Verzehr entwickelt werden könnte. Diese Technologie kann für die Entwicklung anderer extrem sauerstoffempfindlicher Bakterien als Probiotika der nächsten Generation genutzt werden, um Patientenpopulationen mit geringerer Häufigkeit dieser Bakterien anzusprechen.

Zehn Mikrogramm einer frischen Stuhlprobe eines gesunden männlichen Spenders im Alter von 36 Jahren, der in den letzten 6 Monaten keine Antibiotika erhalten hatte, wurden direkt auf PGM-Agarplatten geimpft und anaerob inkubiert (5 % H2, 10 % CO2 und N2 als gemahlener Stoff). Gas) bei 37 °C in einer Coy-Kammer (Coy Laboratory Products). PGM ist ein Wachstumsmedium, das häufig zur Isolierung sulfatreduzierender Bakterien verwendet wird.

Zur Gewinnung von Reinkulturen wurden klassische mikrobiologische Techniken eingesetzt. Nach aufeinanderfolgenden Subkulturen wurden zufällige Kolonien ausgewählt und einer Gram-Färbung unterzogen. Es wurden mutmaßliche Zelltypen von F. prausnitzii und D. piger beobachtet. Nach wiederholter Subkultivierung auf YCFAG- und PGM-Medien, die das Wachstum von F. prausnitzii bzw. D. piger unterstützen, wurden Reinkulturen von F. prausnitzii und D. piger erhalten und die Isolate durch vollständige 16S-rRNA-Gensequenzierung identifiziert. Die Isolate wurden gemäß dem Budapester Vertrag beim Leibniz-Institut DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH hinterlegt und in der Sammlung als F. prausnitzii DSM 32186 und D. piger DSM 32187 aufgeführt.

Der F. prausnitzii-Stamm DSM 32186 wurde routinemäßig unter streng anaeroben Bedingungen in einer anaeroben Coy-Kammer gehalten. Das Routinekulturmedium war YCFAG, enthaltend: 2,5 g l-1 Hefeextrakt, 10 g l-1 Casiton, 4,5 g l-1 Glucose, 0,9 g l-1 Natriumchlorid, 0,45 g l-1 Dikaliumphosphat, 0,45 g l-1 Kaliumdihydrogenphosphat, 1,32 g l-1 Ammoniumsulfat, 4 g l-1 Natriumbicarbonat, 1 g l-1 Cystein, 0,001 g l-1 Resazurin, 0,01 g l-1 Hämin, 100 µg l-1 Biotin, 100 µg l-1 Cobalamin, 300 µg l-1 1 p-Aminobenzoesäure, 500 µg l−1 Folsäure und 1.500 µg l−1 Pyridoxamin. Alle Komponenten wurden aseptisch zugegeben, während die Röhrchen mit CO2 gespült wurden. Die Medien wurden 15 Minuten lang bei 100 kPa und 121 °C autoklaviert. Schließlich wurden Thiamin und Riboflavin durch einen 0,22-µm-Filter auf Endkonzentrationen von 0,05 µg ml−1 zugegeben. Die Endkonzentrationen der SCFAs im Medium betrugen 33 mM Acetat, 9 mM Propionat und jeweils 1 mM Isobutyrat, Isovalerat und Valerat.

D. piger DSM 32187 wurde in PGM beibehalten. PGM enthält: 0,5 g l-1 Dikaliumphosphat, 1 g l-1 Ammoniumchlorid: 3,5 g l-1 Natriumlactat, 1 g l-1 Hefeextrakt, 0,1 g l-1 Ascorbat, 0,5 g l-1 Cystein, 1 g l-1 Natrium Chlorid, 10 g l-1 Pepton, 1 g l-1 Natriumsulfat, 1 g l-1 Calciumchlorid, 2 g l-1 Magnesiumsulfat, 0,5 g l-1 Eisensulfat, 0,5 g l-1 Heptahydrat. Natriumsulfat, Magnesiumsulfat-Heptahydrat und Calciumchlorid wurden getrennt autoklaviert, während Eisensulfat-Heptahydrat mit einem 0,22-µm-Filter filtersterilisiert und nach Autoklavieren und Mischen aller Komponenten hinzugefügt wurde. Der endgültige pH-Wert des Mediums wurde auf 7,2 ± 0,2 eingestellt.

Für Co-Kulturexperimente wurde modifiziertes PGM-Medium (mPGM) durch Zugabe von 25 mM Glucose zu PGM hergestellt.

Um die Sauerstofftoleranz bei F. prausnitzii DSM 32186 zu erhöhen, wurde ein maßgeschneiderter Bioreaktor (m-SHIRM) verwendet (Abb. 2b). In einer anaeroben Coy-Kammer wurde ein Inokulum durch Beimpfen einer einzelnen Bakterienkolonie in 7 ml YCFAG hergestellt. Nach 16-stündiger Inkubation bei 37 °C (optische Dichte bei 600 nm (OD600) ≈ 0,7) wurden 2,5 ml dieser Vorkultur in die Anodenkammer des m-SHIRM-Bioreaktors mit 250 ml YCFAG inokuliert. Die angelegten elektrischen Oxidationspotentiale wurden über eine externe Spannung an einer Graphitanode (8,5 cm × 0,25 cm × 2,5 cm) über einen Potentiostat (CHI, 660 °C) aufrechterhalten. Der m-SHIRM-Bioreaktor wurde vor der Inokulation auf 37 °C gehalten und 15 Minuten lang mit Stickstoffgas gespült. Nach 24 Stunden (OD600 ≈ 0,7) wurden 2,5 ml der Bakterienkultur erneut in einen anderen m-SHIRM-Bioreaktor mit denselben Wachstumsbedingungen, mit Ausnahme von Verschiebungen im anodischen Potential und in den Cystein/Cystin-Konzentrationen, inokuliert. Dieses Verfahren wurde zehnmal mit zunehmendem anodischem Potenzial und abnehmendem Cystein/Cystin-Verhältnis wiederholt (wie in Abb. 2c grafisch dargestellt).

Während der in Abb. 2c dargestellten Subkulturschritte wurden Aliquots von 100 µl gesammelt und seriell in 900 µl Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) verdünnt. Aliquote von 50 µl aus jeder Verdünnung wurden auf YCFAG geimpft und 72 Stunden lang anaerob inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Zahl der lebensfähigen Tiere bestimmt. Basierend auf dem unterschiedlichen Koloniemorphotyp wurden Kolonien ausgewählt (Extended Data Abb. 3) und als Glycerinvorräte (YCFAG mit 20 % Glycerin) bei –80 °C konserviert. Die sauerstoffadaptierten Varianten wurden mittels Gram-Färbung auf Reinheit überprüft.

Die Sauerstofftoleranz von F. prausnitzii DSM 32186 und seinen Varianten wurde in YCFAG und in PGM-Medium für D. piger DSM 32187 bewertet. Die Stämme wurden 14 Stunden lang anaerob in Brühemedium vorkultiviert. Nach der Kultivierung wurden zehnfache Reihenverdünnungen anaerob hergestellt und 100 µl jeder Verdünnung auf zwei Sätze jedes YCFAG- oder PGM-Agarmediums geimpft. Unter anaeroben Bedingungen inkubierte Platten dienten als Kontrolle der Lebensfähigkeit für Platten, die 20 Minuten lang der Umgebungsluft ausgesetzt waren und zur Bestimmung der Sauerstofftoleranz verwendet wurden. Die Sauerstoffdiffusion wurde durch die Oxidation des im YCFAG-Medium vorhandenen Resazurin-Farbstoffs bestätigt. Nachdem sie der Umgebungsluft ausgesetzt worden waren, wurden die Platten 72 Stunden lang anaerob in einer Coy-Kammer inkubiert, bevor die KBE gezählt wurden.

Glukose, SCFA und Laktat wurden mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Brechungsindexdetektion gemessen. Zwanzig Mikroliter zentrifugierte und filtersterilisierte Kulturbrühe wurden auf eine Reprogel H 9 µm-Säule (250 × 4,6 mm) mit einer Vorsäule injiziert. Jasco AS-2507 plus Autoinjektor Die Proben wurden auf 4 °C gekühlt und 0,0025 M Schwefelsäure wurde als Eluent mit einer Flussrate von 400 µl/min mit einer UltiMate 3000-Pumpe von Dionex verwendet. Peaks wurden mit dem Bischoff 8020 RI-Detektor erkannt.

Wie bereits beschrieben, kann F. prausnitzii Riboflavin für den extrazellulären Elektronentransfer zur Anode in einer mikrobiellen Brennstoffzelle nutzen19. YCFAG-Agarplatten wurden mit F. prausnitzii DSM 32186 und DSM 32379 aus gefrorenen Glycerinvorräten, die bei –80 °C aufbewahrt wurden, beimpft und anaerob (5 % H2, 10 % CO2 und N2) bei 37 °C in einer Coy-Kammer (Coy Laboratory Products) inkubiert ). Einzelne Kolonien wurden in 6 ml YCFAG-Brühe inokuliert und über Nacht anaerob bei 37 °C inkubiert. Als die Kulturen eine OD600 von ~0,9 erreichten, wurden die Zellen durch 20-minütige Zentrifugation bei 4.000 U/min geerntet. Das Zellpellet wurde in 200 µl Anolyt resuspendiert und in die Anodenkammer injiziert. Die Zellen wurden 5 Minuten lang inkubiert, bevor sie mit 200 µM Riboflavin als Elektronenvermittler behandelt wurden.

Die maßgeschneiderte mikrobielle Zweikammer-Brennstoffzelle wurde wie zuvor beschrieben mit einigen Modifikationen zusammengebaut36. Das Bettvolumen der Kathoden- und Anodenkammer betrug 9 ml und das Arbeitsvolumen 6 ml. Die beiden Kammern waren durch ein Septum aus CMI-7000S-Kationenaustauschermembran (Membranes International) mit 1,8 cm Durchmesser getrennt. Als Kathode und Anode wurden Graphitplatten mit den Abmessungen 2 cm × 1 cm × 0,2 cm verwendet. Der Abstand zwischen den beiden Elektroden betrug 10 cm. Die Elektroden wurden mit isolierten Kupferdrähten an den externen Stromkreis angeschlossen und der Stromkreis über einen festen Widerstand von 150 Ω geschlossen. Die Anodenkammer enthielt 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) als Anolyt und 0,1 M Glucose. Die Kathodenkammer enthielt 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 50 mM Kaliumferricyanid als Katholyt. Die Zelle wurde auf 37 °C gehalten und die Anoden- und Kathodenkammern wurden kontinuierlich mit Stickstoffgas bzw. Luft gespült. Die Daten wurden mit einem LabJack-Datenerfassungssystem (LabJack Corporation) im Abstand von 1 Minute aufgezeichnet.

Caco-2 aus der European Collection of Cell Cultures (Charge 18H036, Merck) wurden in ergänztem Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (PAA Laboratories) bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator kultiviert. Die Zellen wurden mit verschiedenen F. prausnitzii-Überstandsfraktionen inkubiert, die in LYBHI (1:25 und 1:10 in DMEM-Medium) kultiviert wurden, und 6 Stunden lang mit (4 ng ml−1 IL-1β) stimuliert. Die IL-8-Spiegel wurden in Zellüberständen mit dem ELISA-Kit DuoSet (R&D Systems) doppelt bestimmt. Die Zellen wurden regelmäßig auf Mykoplasmeninfektionen getestet.

Männliche und weibliche 8 Wochen alte Swiss Webster-Mäuse wurden gemeinsam mit 5 Mäusen pro Käfig bei einer Temperatur von 20 ± 1 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 45–70 % unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen bei 12-stündigem Licht gehalten :Dunkelzyklus (Licht von 07:00 bis 19:00 Uhr) und erhielten eine autoklavierte Chow-Diät (LabDiet) und Wasser nach Belieben. Den Mäusen wurde fünfmal in der ersten Woche und dann zweimal pro Woche in den folgenden drei Wochen entweder eine Bakterienkultur mit F. prausnitzii DSM 32379 und D. piger DSM 32187 oder ein Medium/Glycerin-Vehikel verabreicht. Die gesamte genomische DNA wurde wie zuvor beschrieben aus dem Blinddarminhalt der Maus isoliert37 und mit dem Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen) quantifiziert. F. prausnitzii und D. piger wurden durch qPCR unter Verwendung der Primer Fpr-2F (GGAGGAAGAAGGTCTTCGG)/Fprau645-R (AATTCCGCCTACCTCTGCAC)38,39 und DSV691-F (CCGTAGATATCTGGAGGAACATCAG)/DSV826-R (ACATCTAGCATCCATCGTTTACAGC)40 quantifiziert. Klinische Beobachtungen wurden einmal täglich durchgeführt. Klonische oder tonische Bewegungen, stereotypes oder abnormales Verhalten wurden überwacht. Körpergewicht und Nahrungsaufnahme wurden überwacht. Zu den durchgeführten hämatologischen Untersuchungen gehörten Hämatokrit, Hämoglobinkonzentration, Erythrozytenzahl, Gesamt- und Differenzleukozytenzahl sowie Thrombozytenzahl. Klinisch-biochemische Untersuchungen der durchgeführten Blutproben umfassten Natrium, Kalium, Harnstoff, Gesamtcholesterin, Blutharnstoffstickstoff, Kreatinin, Gesamtprotein, Gesamtalbumin, Alaninaminotransferase, alkalische Phosphatase, Gamma-Glutamyltranspeptidase und Gallensäuren. Die histopathologische Untersuchung wurde an Magen, Zwölffingerdarm, Dünn- und Dickdarm (einschließlich Peyer-Plaques), Leber, Milz, Thymus und mesenterialen Lymphknoten durchgeführt. Klinische Beobachtungen, Körpergewicht, Nahrungsaufnahme, Beurteilung des Organgewichts und Autopsien wurden ohne Verblindung durchgeführt. Bluthämatologie, klinische Biochemie und Histopathologie wurden von verblindetem externen Personal beurteilt. Es wurde keine Berechnung der Stichprobengröße oder Randomisierung durchgeführt. Alle Tierversuche wurden von der Göteborger Tierethikkommission genehmigt (Dnr 5.8.18-16056/2019).

Bei der Studie handelte es sich um eine doppelblinde, randomisierte, placebokontrollierte, monozentrische Studie über 10 Wochen an gesunden Männern und Frauen im Alter von 20 bis 40 Jahren. Berechtigte Teilnehmer erhielten nach dem Zufallsprinzip einmal täglich Kapseln mit einer hohen (1 × 109 bis 5 × 109 KBE pro Bakterienstamm; n = 18) oder niedrigen Dosis (1 × 108 bis 5 × 108 KBE; n = 16) D. piger und F. prausnitzii oder Placebo (n = 16) für 8 Wochen, gefolgt von einem 2-wöchigen Zeitraum ohne Nahrungsergänzung. Insgesamt schlossen 16 (hohe Dosis), 16 (niedrige Dosis) und 14 (Placebo) Teilnehmer die gesamte Studie ab. Kein Studienteilnehmer brach die Studie aufgrund eines unerwünschten Ereignisses ab. Die Randomisierung wurde vom Sponsor (Metabogen) mithilfe von Sealed Envelope (2017, https://www.sealedenvelope.com/simple-randomiser/v1/lists) durchgeführt. Die Randomisierung erfolgte stratifiziert nach Geschlecht. Informationen zu Studiendesign, Analyse und Studienzielen wurden vor Studienbeginn auf Clinicaltrials.gov (NCT03728868) veröffentlicht. Die Studie wurde vom Regional Ethics Review Board in Göteborg genehmigt.

Teilnehmende Freiwillige wurden durch Werbung in sozialen Medien (z. B. auf Facebook und Instagram) und durch Plakate in öffentlichen Bereichen (z. B. in Universitäten, Krankenhäusern und Fitnessstudios) rekrutiert. Teilnehmer, die alle Einschlusskriterien erfüllten (20–40 Jahre alt, unterzeichnete Einverständniserklärung, gesund ohne bekannte Krankheit, Bereitschaft und Fähigkeit, an geplanten Besuchen, Telefoninterviews teilzunehmen und Anweisungen zu befolgen, gesprochenes und geschriebenes Schwedisch verstehen), wurden nicht ausgeschlossen Kriterien (laufende Behandlung mit verschriebenen Medikamenten, Einnahme probiotischer Nahrungsergänzungsmittel, Behandlung mit Antibiotika innerhalb der letzten drei Monate, Schwangerschaft, Magen-Darm-Trakt-Symptome in den letzten Monaten, die sich auf die Studienteilnahme auswirken könnten, aktueller Tabakkonsum, Teilnahme an anderen klinischen Studien) waren normal Blutbiochemie, Blutdruck und Herzfrequenz wurden zur Teilnahme eingeladen.

Der primäre Endpunkt war die Verträglichkeit und wurde anhand eines Abbruchs (ja/nein) aufgrund des Prüfpräparats während der 8-wöchigen Behandlung getestet. Sekundäre Endpunkte einschließlich Veränderung (zwischen dem Ausgangswert und 8 Wochen) der Gastrointestinal Symptom Rating Scale (GSRS), Nüchternblutzucker, glykosyliertes Hämoglobin (HbA1c), Nierenfunktion (geschätzte glomeruläre Filtrationsrate (eGFR) basierend auf Serumkreatinin), rot und weiß Blutzellzahl, Serum-Alanin-Transaminase (ALT), Serum-Aspartat-Transaminase (AST), Serum-alkalische Phosphatase (ALP), Serum-Bilirubin, Serum-C-reaktives Protein (CRP), Serum-Gesamtprotein, SCFA-Spiegel im Stuhl (Butyrat, Acetat, Laktat). , Proprionat, Isovalerat, Isobutyrat und Succinat) wurden zwischen dem Ausgangswert und Woche 4 und 8 (und nach 10 Wochen für SCFAs) bewertet.

Während der Studiendauer waren sechs Besuche in der Studienklinik (Geriatrische Medizin, Sahlgenska-Universitätskrankenhaus, Mölndal) erforderlich. Die Teilnehmer erhielten sowohl schriftlich als auch mündlich Informationen über die Studie. Berechtigte Teilnehmer ohne Ausschlusskriterien legten vor allen Studienverfahren und der Einschreibung eine unterschriebene Einverständniserklärung vor. Herzfrequenz und Blutdruck wurden beim Screening-Besuch zweimal mit einem Carescape V100-Gerät (GE Healthcare) gemessen. Körpergröße, Gewicht sowie Taillen- und Hüftumfang wurden mit einem Stadiometer sowie einer Waage und einem Maßband gemessen. Venöses Blut wurde aus der Kubitalvene entnommen und für blutbiochemische Analysen verwendet. Die gesamte Blutbiochemie wurde innerhalb von 4 Stunden nach der Probenahme im Labor für klinische Chemie (Sahlgrenska-Universitätskrankenhaus Mölndal) analysiert. Alle Frauen absolvierten außerdem einen Schwangerschaftstest (humanes Choriongonadotropin im Urin), der für die Aufnahme negativ ausfallen musste.

Beim Randomisierungsbesuch wurden Stuhlproben entnommen und die GSRS durchgeführt, um Informationen über etwaige Magen-Darm-Symptome der Vorwoche zu sammeln. Alle Teilnehmer erhielten ein Tagebuch zur Aufzeichnung der täglich eingenommenen Dosen und zum Notieren möglicher unerwünschter Ereignisse. Bei den Studienbesuchen drei bis fünf wurden Kot- und Blutproben sowie Daten aus dem GSRS-Fragebogen gesammelt. Zwei Wochen nach Abschluss der Behandlung fand ein letzter Studienbesuch statt, um Daten zu gastrointestinalen Symptomen (GSRS) zu sammeln und Stuhlproben zu sammeln. Die ersten 15 randomisierten Probanden wurden in der ersten Woche täglich telefonisch kontaktiert, um sich nach möglichen unerwünschten Ereignissen zu erkundigen. Danach wurden alle Teilnehmer einmal pro Woche telefonisch kontaktiert, um Fragen zu unerwünschten Ereignissen zu stellen und Informationen zu gastrointestinalen Symptomen (GSRS) in der Vorwoche zu sammeln.

Das Studienprodukt wurde in Form von gefriergetrockneten Bakterien bereitgestellt, die in Kapseln verpackt waren, die so gestaltet waren, dass sie beim Erreichen des Dünndarms zerfielen. Für das Placebo und das Interventionsprodukt wurden identische Kapseln und Hilfsstoffe verwendet.

Die Beurteilung der Magen-Darm-Symptome der letzten Woche erfolgte mithilfe des GSRS-Fragebogens41. GSRS enthält insgesamt 15 Punkte und wurde als Gesamtpunktzahl im Bereich von 0 bis 45 analysiert. Die Werte 0–9 entsprechen keinem bis minimalen Magen-Darm-Problemen, 10–19 entsprechen minimalen Magen-Darm-Problemen, 20–29 entsprechen mäßigen Magen-Darm-Problemen und 30 –39 entsprechen mittelschweren bis schweren Magen-Darm-Problemen und 40–45 entsprechen schweren Magen-Darm-Problemen.

Alle blutbiochemischen Analysen wurden im von Swedac akkreditierten (Akkreditierungsnummer 1240) Labor für klinische Chemie am Sahlgrenska-Universitätskrankenhaus durchgeführt. Der Blutzucker wurde mit Glucose HK auf einem Cobas 6000-Gerät (Roche Diagnostics Scandinavia) gemessen. Der Varianzkoeffizient (CV) betrug 3 % bei Konzentrationen von 5 und 15 mM. HbA1c wurde mittels HPLC (Mono S, Tricorn 50/50 GL (CDP), MonoBeads Column (GE Healthcare)) gemessen. Die abgetrennten Hämoglobinfraktionen wurden mit einem UV-Detektor gemessen und die Absorption bei 417 nm quantifiziert. Der CV betrug 2 % bei Konzentrationen von 42 mmol pro mol, 63 mmol pro mol und 94 mmol pro mol. Die Erythrozytensedimentationsrate wurde mit dem Starrsed ST Instrument, Mechatronics (Triolab) gemessen. Die Erythrozytenzahl (CV: 3 % bei 2, 4 und 5 × 1012 l−1) wurde unter Verwendung von antikoaguliertem venösem Blut mit K2-EDTA und Messung der Lichtabsorption gemessen. Das verwendete Gerät war das ADVIA 2120i (Siemens Medical Solutions Diagnostics). Die Leukozytenzahl wurde unter Verwendung von antikoaguliertem venösem Blut mit K2-EDTA und Messung der Lichtabsorption unter Verwendung des ADVIA 2120i-Instruments (Siemens Medical Diagnostics AB) mit einem CV von 7 % bei Konzentrationen von 3 × 109 l−1 bis 16 × gemessen 109 l−1. Die Thrombozytenzahl wurde unter Verwendung von antikoaguliertem venösem Blut mit K2-EDTA und Messung der Lichtabsorption mit einem CV von 9 % bei 80, 200 und 500 × 109 l−1 gemessen und auf einem ADVIA 2120i-Gerät analysiert. ALT katalysiert die Reaktion zwischen L-Alanin und 2-Oxoglutarat. Eine weitere Reaktion zwischen dem produzierten Pyruvat und NADH erzeugt ein Maß für die NADH-Oxidation, das direkt proportional zur ALT-Aktivität war, die über die Abnahme der Absorption gemessen wurde. Der CV betrug 6 % bei 1 µkat l−1 und 4 % bei 4 µkat l−1 und das verwendete Gerät war das Cobas 6000. AST katalysiert L-Aspartat und 2-Oxoglutatrat zu Oxalacetat und L-Glutamat. Die Reaktion zwischen Oxalacetat und NADH erzeugt ein Maß für die NADH-Oxidation, das direkt proportional zur AST-Aktivität war, die über die Abnahme der Absorption gemessen wurde. Der CV betrug 5 % bei 1 µkat l−1 und 3 % bei 3 µkat l−1 und das verwendete Gerät war das Cobas 6000. ALP wurde mit einem kolorimetrischen Assay unter Verwendung von Cobas 6000 mit einem CV von 4 % bei 7 µkat l− analysiert 1. Das Gesamtbilirubin im Serum wurde mithilfe eines kolometrischen Assays auf einem Cobas-System (Roche Diagnostics Scandinavia) mit einem CV von 5 % bei Konzentrationen von 20 und 130 µM gemessen. Serumkreatinin wurde mithilfe von CREP2 auf einem Cobas 6000-Gerät mit einem CV von 4 % bei Konzentrationen von 85 und 400 μM gemessen. Die geschätzte glomeruläre Filtrationsrate (eGFR) wurde mithilfe der Lund-Malmö-Formel basierend auf Serumkreatinin, Alter und Geschlecht42 berechnet. Das Gesamtprotein wurde mit einem Cobas 6000 mit einem CV von 3 % bei Konzentrationen von 50 und 75 g/l gemessen.

Die Stuhlkonzentrationen der SCFAs Acetat, Propionat und Butyrat sowie Succinat und Lactat wurden mithilfe der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (Agilent Technologies) wie zuvor beschrieben bestimmt43. Kurz gesagt, 100 mg gefrorenes Fäkalienmaterial wurden in ein 16 × 125 mm großes Röhrchen mit Schraubverschluss überführt und ein Volumen von 100 µl interner Standard-Stammlösung ([1-13C]Acetat, [2H6]Propionat 1 M, [13C4]Butyrat 0,5 M, [1-13C1]Isobutyrat und [1-13C]Isovalerat 0,1 M) wurden zugegeben. Vor der Extraktion wurden die Proben über Nacht gefriergetrocknet. Nach dem Ansäuern mit 50 µl 37 %iger HCl wurden die organischen Säuren zweimal in 2 ml Diethylether extrahiert. Ein 500-µl-Aliquot der extrahierten Probe wurde mit 50 µl N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoracetamid (Sigma) bei 20 °C gemischt. Ein Mikroliter des gewonnenen Materials wurde in einen Gaschromatographen (Agilent Technologies 7890 A) injiziert, der mit einem Massenspektrometerdetektor (Agilent Technologies 5975 C) gekoppelt war. Die Temperatur wurde in einem linearen Gradienten erhöht, bestehend aus einer Anfangstemperatur von 65 °C für 6 Minuten, einem Anstieg auf 260 °C bei 15 °C pro Minute und einem Anstieg auf 280 °C und Halten für 5 Minuten. Die Temperaturen des Injektors und der Transferleitung betrugen 250 °C. Die Quantifizierung wurde im Ionenüberwachungs-Erfassungsmodus durch Vergleich mit markierten internen Standards mit den m/z-Verhältnissen 117 (Essigsäure), 131 (Propionsäure), 145 (Buttersäure), 146 (Isobuttersäure), 159 (Isovaleriansäure) durchgeführt ), 121 ([2H2,1-13C]Acetat), 136 ([2H5]Propionat), 146 ([1-13C1]Isobutyrat), 149 ([13C4]Butyrat), 160 ([1-13C]Isovalerat).

Die statistische Aussagekraft wurde auf der Grundlage der erwarteten Unterschiede im Anteil der Studienteilnehmer berechnet, die aufgrund unerwünschter Ereignisse die Studie abbrachen. Mit einer Abbruchrate von 0,50 gegenüber 0,05 aufgrund des Prüfpräparats in den beiden Behandlungsgruppen gegenüber der Placebogruppe (randomisiert in 2:1, 32 gegenüber 16 Probanden) mit einem Alpha-Wert von 0,05, unter Verwendung des zweiseitigen exakten Fisher-Tests Es wurde eine Leistung von 88 % erreicht.

Alle Analysen wurden sowohl in der Intention-to-Treat-Population als auch in den Per-Protocol-Populationen durchgeführt. Der Vergleich kontinuierlicher Variablen zwischen Behandlungsgruppen (niedrige und hohe Dosis) und Placebo wurde mit dem nichtparametrischen Permutationstest nach Fisher durchgeführt, und für dichotome Variablen wurde der exakte Test nach Fisher (niedrigster einseitiger P-Wert multipliziert mit 2) verwendet. Der primäre Endpunkt war die Verträglichkeit und wurde anhand eines Abbruchs (ja/nein) aufgrund des Prüfpräparats während der 8-wöchigen Behandlung getestet. Die potenziellen Unterschiede in den sekundären Endpunktvariablen wurden anhand der um Placebo bereinigten relativen Veränderung bewertet und mit dem nichtparametrischen Permutationstest nach Fisher verglichen, der auch das Konfidenzintervall für die mittlere Differenz generierte. Alle Analysen wurden an vollständigen Fällen durchgeführt, d. h. es wurden keine Imputationen verwendet. Die statistische Signifikanz wurde für P-Werte unter 0,05 berücksichtigt und alle Statistiken wurden mit SAS Software Version 9.4 (SAS Institute) durchgeführt. Konfidenzintervalle für primäre Ergebnisse wurden mithilfe des Newcombe-Hybrid-Score-Intervalls44 berechnet. Permutationsbasierte Konfidenzintervalle (Ergänzungstabellen 5–8) wurden mithilfe eines vom Benutzer geschriebenen SAS-Makros45,46 (https://github.com/imbhe/PermTestCI) berechnet.

Schwefelwasserstoff wurde wie zuvor beschrieben quantifiziert47. Alle Reagenzien und Puffer wurden durch Spülen mit Stickstoff entgast. Stuhlproben wurden geschnitten und auf Trockeneis aliquotiert (~150 mg) und in luftdichten 2-ml-Propylenröhrchen gefroren aufbewahrt. Die Proben wurden dann in eine anaerobe Kammer (COY) überführt und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt. Verdünnte Fäkalienschlämme wurden mit einer Zinkacetatlösung behandelt, bevor eine Reagenzlösung bestehend aus N,N-Dimethyl-p-phenylendiaminsulfat zugegeben wurde. Die Röhrchen wurden sofort verschlossen, vortexiert und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten und die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 670 nm gemessen. Schwefelwasserstoff wurde in Stuhlproben von 40 Personen (Placebo, n = 12; niedrige Dosis, n = 16; hohe Dosis, n = 12) gemessen, die sowohl zu Beginn als auch am Ende der Verabreichung Stuhlgang hatten; Für eine Person in der Placebogruppe und zwei Personen in der Hochdosisgruppe stand nicht ausreichend Material zur Verfügung.

Stuhlproben wurden von den Teilnehmern zu Hause gesammelt und bis zur Lieferung in die Klinik bei Raumtemperatur gelagert, wo die Proben bei –80 °C gelagert wurden. Die maximale Zeitspanne zwischen Probenahme und Lieferung an die Klinik betrug 24 Stunden. Die gesamte genomische DNA wurde aus 100–150 mg Fäkalienmaterial unter Verwendung einer Modifikation des IHMS-DNA-Extraktionsprotokolls Q48 isoliert. Die Proben wurden in Lysing Matrix E-Röhrchen (MP Biomedicals) extrahiert, die ASL-Puffer (Qiagen) enthielten, 2 Minuten lang gevortext und durch zwei 10-minütige Erhitzungszyklen bei 90 °C, gefolgt von zwei Perlenschlagstößen mit 5,5 m s−1, lysiert 60 s in einem FastPrep-24 Instrument (MP Biomedicals). Nach jedem Perlenschlagstoß wurden die Proben 5 Minuten lang auf Eis gelegt. Die Überstände wurden nach jedem Zyklus durch Zentrifugation bei 4 °C gesammelt. Die Überstände aus den beiden Zentrifugationsschritten wurden gepoolt und ein 600-µl-Aliquot jeder Probe mit dem QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) im QIAcube (QIAGEN)-Gerät unter Verwendung des Verfahrens zur Analyse menschlicher DNA gereinigt. Die Proben wurden in 200 µl AE-Puffer (10 mM Tris·Cl; 0,5 mM EDTA; pH 9,0) eluiert. Bibliotheken für die metagenomische Shotgun-Sequenzierung wurden mit einer PCR-freien Methode erstellt; Die Vorbereitung und Sequenzierung der Bibliothek wurde bei Novogene (China) auf einem NovaSeq-Instrument (Illumina) mit 150-bp-Paired-End-Reads und mindestens 6G-Daten pro Probe durchgeführt.

Die gesamte genomische DNA wurde aus mikrobieller Biomasse extrahiert, die nach einem Wachstum über Nacht oder in der stationären Phase geerntet wurde. Aus Flüssigkulturen gewonnene Biomasse wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 4.500 U/min und 4 °C gesammelt und einmal mit PBS gewaschen, um verschleppte Verunreinigungen zu entfernen.

DNA für die Illumina-Short-Reads-Sequenzierung wurde mit dem NucleoSpin Soil Kit (740780.50, Macherey-Nagel) wie vom Hersteller beschrieben in Gegenwart von SL2-Lysepuffer und Sx-Enhancer extrahiert. Die Zellen wurden durch zwei Runden Perlenschlagen bei 5,5 m s−1 für 60 s in einem FastPrep-24-Instrument (MP Biomedicals) lysiert, mit 5-minütiger Inkubation auf Eis zwischen den beiden Perlenschlagen. Die DNA-Qualität wurde mit Tapestation 4200 mit Genomic DNA ScreenTape und Reagenzien (Agilent) bewertet und die Quantifizierung erfolgte mit dem Quant-iT dsDNA BR Assay Kit (ThermoFisher Scientific). Bibliotheken für die Sequenzierung wurden mit dem fokussierten Ultraschallgerät Covaris S220 (Covaris), fragmentiert auf eine durchschnittliche Insertgröße von 550 bp, und dem TruSeq DNA PCR-freien Bibliotheksvorbereitungskit (20015963 und 20015949, Illumina) vorbereitet. Die Bibliotheken wurden mit dem Quant-iT dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher Scientific) quantifiziert und auf einem Illumina Miseq-Gerät unter Verwendung des MiSeq Reagent Kit v3, 600 Zyklen, sequenziert.

Mit einer modifizierten Version des Marmur-Verfahrens wurden große Mengen hochwertiger DNA für die Nanopore-Long-Reads-Sequenzierung erhalten49. Die Zellen wurden in Tris-EDTA-Puffer (20 mM Tris HCl pH 8, 2 mM EDTA) suspendiert und mit Lysozym (20 mg ml−1) und SDS (2 % w/v) in Gegenwart von Proteinase K lysiert. Die extrahierte Gesamtmenge Die DNA wurde durch wiederholte Extraktion in Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1 v/v) und Chloroform:Isoamylalkohol (24:1 v/v) gereinigt, gefolgt von einer Präzipitation in kaltem Ethanol (99,5 % v/v). und Aufwickeln der DNA auf einen Glasstab. Die DNA wurde mit 70 %igem Ethanol (v/v) gewaschen, bei Raumtemperatur getrocknet und über Nacht bei 4 °C in Wasser resuspendiert. Die DNA-Integrität und -Konzentration wurden mithilfe der Tapestation 4150 mit Genomic DNA ScreenTape und Reagenzien (Agilent) sowie dem Qubit 3.0 Fluorometer und dem Qubit dsDNA BR-Assay-Kit (ThermoFisher Scientific) bewertet. Isolierte DNA wurde mit dem Rapid Barcoding Kit (SQK-RBK004) gemäß den Anweisungen des Herstellers (ONT) hergestellt und auf einem MinION-Gerät von ONT auf einer R9.4.1-Durchflusszelle (FLO-MIN106D) sequenziert. Das Base-Calling wurde mit ONTs Guppy Version 4.2.2 durchgeführt.

Die Genome von F. prausnitzii DSM 32186 und DSM 32379 und D. piger DSM 32187 wurden durch Hybridassemblierung von Nanopore- und Illumina-Reads erhalten. Die Unicycler-Pipeline v0.4.8 im Hybridmodus wird zum Erhalten von De-novo-Assemblys verwendet. Alle Abhängigkeiten für Unicycler wurden in einer Conda-Umgebung installiert. Zu den Abhängigkeitsprogrammen gehören SPAdes v3.13.0, racon v1.4.1, bowtie2 v2.3.5.1 und pilon v1.23. Die Hybridbaugruppen wurden mit Prokka v1.14.5 (https://github.com/tseemann/prokka) kommentiert.

Um auf evolutionäre Beziehungen schließen zu können, wurden die Genome von F. prausnitzii und D. piger mit öffentlich zugänglichen hochwertigen Genomen derselben Art und/oder repräsentativen Sequenzen zuvor bekannter Kladen, ihrer nahen Nachbarn bzw. Außengruppen unter Verwendung von progressiveMauve50 abgeglichen. Mehrere Alignments wurden verwendet, um die Phylogenien beider Stämme in MEGA X51 zu rekonstruieren. Die evolutionären Abstände wurden mithilfe der Maximum-Composite-Likelihood-Methode berechnet und sind in Einheiten der Anzahl der Basensubstitutionen pro Standort angegeben52.

Illumina-Lesevorgänge wurden mit fastq_quality_trimmer aus dem FastX-Toolkit (https://github.com/lianos/fastx-toolkit/) qualitätsgefiltert und getrimmt. Menschliche Lesevorgänge wurden entfernt, indem die hochwertigen Lesevorgänge mithilfe von Bowtie2 (Lit. 53) (v2.4.4) auf das menschliche Genom (hg19) abgebildet wurden. Nach der Entfernung minderwertiger (Qualitätsbewertung <20) und menschlicher Messwerte erhielten wir hochwertige Paired-End-Mikrobenwerte mit einer durchschnittlichen Tiefe von 45 Millionen für jede Stuhlprobe.

Zur Genomerfassung wurden hochwertige mikrobielle Lesevorgänge mithilfe von Kraken 2 (Ref. 54) (v2.1.2) mit Standardeinstellungen anhand einer benutzerdefinierten Datenbank kartiert, die durch Hinzufügen der geschlossenen Genome der neuen Stämme F. prausnitzii DSM 32186 und D. piger erstellt wurde DSM 32187 zur RefSeq-Datenbank (Version 107). Schätzungen der Stammhäufigkeit wurden mit Bracken55 (v2.6.2) für Lesevorgänge mit einer Mindestlänge von 100 bp erhalten.

Die Gesamtzusammensetzung der Darmmikrobiota wurde hinsichtlich der Artenhäufigkeit mithilfe einer Hauptkoordinatenanalyse zur Bray-Curtis-Unähnlichkeit bewertet. Unterschiede in der Zusammensetzung wurden durch eine permutationelle multivariate ANOVA unter Verwendung der Adonis2-Funktion mit 10.000 Permutationen im veganen Paket in R (https://github.com/vegandevs/vegan/) getestet.

Die Genzahlen in den metagenomischen Daten wurden mithilfe von MEDUSA56 mit einem Genkatalog geschätzt, der 15.186.403 nicht-redundante mikrobielle Gene6 enthielt. Das Butyratproduktionspotenzial wurde anhand von fünf Genen (but, buk 4hbt und atoA/D) quantifiziert, die für die terminalen Enzyme in den vier intestinalen Butyratproduktionswegen kodieren57. Profil-Hidden-Markov-Modelle wurden verwendet, um diese Gene im Genkatalog zu screenen, wie zuvor beschrieben6.

Für den sauerstofftoleranten F. prausnitzii DSM 32379 wurden genetische Varianten entdeckt, indem die Rohdaten mit dem zusammengesetzten Genom des Elternstamms DSM 32186 unter Verwendung von Snippy v4.4.5 in der Standardeinstellung kartiert wurden (https://github.com/tseemann/snippy). . Um die genetischen Varianten in den fäkalen Metagenomen zu erkennen, haben wir mithilfe von Bowtie2 v2.3.5.1 eine Lesekartierung von F. prausnitzii auf DSM 32379 in jeder Probe erhalten und anschließend mit Snippy v4.4.5 einen Variantenaufruf gegen das Elterngenom DSM 32186 durchgeführt. F. prausnitzii DSM 32379 wurde nur dann als möglicherweise in einer Probe nachgewiesen angesehen, wenn: (1) genetische Varianten von DSM 32379 erst am Ende der Verabreichung nachgewiesen wurden; (2) die genetischen Varianten, die die verwandten Genomregionen abdecken, hatten eine Häufigkeit von mindestens 10 % aller Reads; und (3) im Falle eines Nachweises zu Studienbeginn müssen am Ende der Verabreichung mehrere Varianten nachgewiesen werden, wobei alle ihre Häufigkeiten in dieser Stuhlprobe zunehmen (Ergänzungstabelle 1).

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism v_8.4.3 durchgeführt. Zum Vergleich zweier Gruppen wurden zweiseitige Student-t-Tests und zum Vergleich dreier Gruppen eine einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Mehrfachvergleich verwendet.

Mithilfe nichtparametrischer Tests wurde die Häufigkeit von Arten und Stämmen in den fäkalen Mikrobiomen verglichen. Wilcoxon-Signed-Rank-Tests wurden verwendet, um die Häufigkeiten am Ende der Verabreichung im Vergleich zum Ausgangswert in passenden Proben einer Einzelperson zu vergleichen. Zum Vergleich dreier Gruppen wurden Kruskal-Wallis-Tests verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Ergänzende Informationen zur Datenverfügbarkeit sind mit der Online-Version des Papiers verlinkt. Genomassemblierungen und rohe metagenomische Sequenzdaten wurden im EMBL-EBI European Nucleotide Archive (ENA) unter der Zugangsnummer PRJEB62463 hinterlegt. Die für die erneute Analyse erforderlichen verarbeiteten Sequenzdaten sind auf GitHub verfügbar (https://zenodo.org/record/8019851). Verarbeitete pseudonymisierte Metadaten pro Subjekt sind in den Ergänzungstabellen 2–8 aufgeführt. Daten aus der Maussicherheitsstudie sind in der Ergänzungstabelle 9 verfügbar. Bei Fragen zur klinischen Kohorte wenden Sie sich bitte an ML. Bakterienstämme sind Eigentum von Metabogen AB und sollten bei dieser angefragt werden.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken A. Hallén, R. Jakubowicz, L. Olsson, M. Bergentall und S. Håkansson für technische Unterstützung; und H. Imberg für die Weitergabe des SAS-Makros für den Fisher-Pitman-Permutationstest und das Konfidenzintervall. Die Berechnungen wurden durch Ressourcen in den Projekten SNIC 2020/5-384 und SNIC 2019/8-169 ermöglicht, die von der schwedischen Nationalen Infrastruktur für Informatik (SNIC) bei UPPMAX bereitgestellt und teilweise vom schwedischen Forschungsrat durch die Fördervereinbarung Nr. finanziert wurden. 2018-05973. Diese Studie wurde teilweise von der Knut and Alice Wallenberg Foundation (2017.0026), dem Swedish Research Council (2019-01599), dem Transatlantic Networks of Excellence Award der Leducq Foundation (17CVD01), AFA Insurances, der Swedish Heart Lung Foundation (20210366) unterstützt. der Stiftung Novo Nordisk (NNF17OC0028232), Zuschüsse des schwedischen Staates im Rahmen der Vereinbarung zwischen der schwedischen Regierung und den Bezirksräten, der ALF-Vereinbarung (ALFGBG-718101) und von Metabogen AB. FB ist Wallenberg-Stipendiat und Torsten-Söderberg-Professor für Medizin.

Open-Access-Finanzierung durch die Universität Göteborg.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Muhammad Tanweer Khan, Chinmay Dwibedi

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Valentina Tremaroli, Mattias Lorentzon, Fredrik Bäckhed

Wallenberg-Labor, Abteilung für Molekulare und Klinische Medizin, Institut für Medizin, Universität Göteborg, Göteborg, Schweden

Muhammad Tanweer Khan, Chinmay Dwibedi, Meenakshi Pradhan, Jamie D. Kraft, Robert Caesar, Valentina Tremaroli und Fredrik Bäckhed

Metabogen, Mölndal, Schweden

Muhammad Tanweer Khan

Institut für Neurowissenschaften und Physiologie, Universität Göteborg, Göteborg, Schweden

Chinmay Dwibedi

Sahlgrenska Osteoporosezentrum, Abteilung für Innere Medizin und klinische Ernährung, Medizinisches Institut, Universität Göteborg, Göteborg, Schweden

Daniel Sundh & Mattias Lorentzon

Region Västra Götaland, Klinik für Geriatrie, Sahlgrenska-Universitätskrankenhaus Mölndal, Mölndal, Schweden

Matthias Lorentzon

Mary MacKillop Institut für Gesundheitsforschung, Australian Catholic University, Melbourne, Victoria, Australien

Matthias Lorentzon

Abteilung für klinische Physiologie, Sahlgrenska-Universitätskrankenhaus, Göteborg, Schweden

Fredrik Bäckhed

Novo Nordisk Foundation Center for Basic Metabolic Research, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, Universität Kopenhagen, Kopenhagen, Dänemark

Fredrik Bäckhed

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MTK isolierte, charakterisierte und adaptierte die Bakterienstämme, entwickelte das Verfahren und entwickelte und produzierte die Formulierung. CD und MP führten bioinformatische Analysen durch. VT-verarbeitete Proben für Mikrobiota-Analysen und interpretierte Ergebnisse mit CD und MPJDK charakterisierten die immunmodulatorischen Eigenschaften von F. prausnitzii. DS führte die Studie am Menschen durch. RC führte die Mausstudie durch. ML entwarf und leitete die Studie zur menschlichen Intervention. VT, ML und FB betreuten das Projekt und leisteten gleichermaßen Beiträge. MTK und FB konzipierten und gestalteten die Studie und verfassten den ersten Entwurf des Papiers. Alle Autoren analysierten die Daten und kommentierten das Manuskript.

Korrespondenz mit Fredrik Bäckhed.

MTK ist teilweise bei Metabogen AB beschäftigt und FB ist Gründer von Metabogen AB. Metabogen AB hat mit wirtschaftlicher Unterstützung und Produkten zum menschlichen Eingriff beigetragen, war jedoch nicht an der Analyse der Daten beteiligt. FB erhält Forschungsgelder von Biogaia AB und ist im wissenschaftlichen Beirat von Bactolife A/S. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature dankt Ruth Ley, Daniel Tancredi und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Modulation der IL-1β-induzierten IL-8-Sekretion durch Caco-2-Zellen in Kontakt mit F. prausnitzii-Überständen (Stamm A2-165 (DSM 17677) als Referenz enthalten). Die Zellen wurden 6 Stunden lang Bakterienüberstand mit oder ohne 4 ng/ml IL-1β ausgesetzt. Die Gruppenbezeichnungen auf der horizontalen Achse zeigen die Verdünnung des gefilterten Mediums aus der F. prausnitzii-Kultur an. p = 0,025 (DSM 32186 vs. A2-165, 1/25), p = 0,0000089 (LYBHI vs. A2-165, 1/25), p = 0,00013 (LYBHI vs. DSM32186, 1/25), p = 0,000016 (LYBHI vs. DSM32379, 1/25), p = 0,0000028 (LYBHI vs. A2-165, 1/10), p = 0,000013 (LYBHI vs. DSM32186, 1/10), p = 0,0000039 (LYBHI vs. DSM32379, 1/10). n = 3, ***p < 0,001, *p < 0,05, bestimmt durch einfaktorielle ANOVA. Die Ergebnisse wurden in zwei unabhängigen Experimenten wiederholt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt

Reihenverdünnungen wurden auf PGM-Platten geimpft, die 20 Minuten lang der Umgebungsluft ausgesetzt waren, und mit Kontrollplatten verglichen, die in einer anaeroben Coy-Kammer inkubiert wurden. Die Zahlen neben den Agarplatten geben die Verdünnung an.

Morphotyp von F. prausnitzii DSM 32379 (Pfeil b), isoliert aus dem m-SHIRM-Bioreaktor während des 10. Subkulturschritts. Als Referenz ist der Elternstamm F. prausnitzii DSM 32186 dargestellt (Pfeil a).

a, Quantifizierung der Sauerstofftoleranz des Elternstamms und sauerstoffadaptierter Varianten in YCFAG. b, Sauerstofftoleranz des sauerstoffangepassten F. prausnitzii DSM 32378. Reihenverdünnungen (oben gezeigt) wurden auf YCFAG-Platten inokuliert und 20 Minuten lang der Umgebungsluft ausgesetzt und mit Kontrollplatten verglichen, die in Anaerobiose inkubiert wurden. c, Metabolitenprofil der elterlichen DSM 32186- und sauerstoffadaptierten Varianten, kultiviert in YCFAG-Medium. Die mM-Änderung auf der y-Achse zeigt den Unterschied zum beimpften Medium zu Beginn an.

a, Koloniebildende Einheiten von parentalem F. prausnitzii DSM 32186 und sauerstofftolerantem DSM 32379 in Monokultur oder Co-Kultur mit D. piger DSM 32187 in modifiziertem Postgate-Medium (d. h. Postgate-Medium mit 25 mM Glucose; mPGM) nach 24 Tage h Wachstum. p = 0,00000073 (DSM 32186), p = 0,00000022 (DSM 32379). b, Metabolitenprofile von F. prausnitzii DSM 32379 und D. piger DSM 32187 als Monokulturen oder Co-Kultur in mPGM nach 24 Stunden Wachstum. Glukose: p = 0,0000008 (F. prausnitzii + D. Mädchen vs. D. Mädchen), p = 0,0000012 (F. prausnitzii + D. Mädchen vs. F. prausnitzii); Laktat: p = 0,0000000001 (F. prausnitzii + D. Mädchen vs. D. Mädchen), p = 0,0000000013 (F. prausnitzii vs. D. Mädchen), p = 0,00018 (F. prausnitzii + D. Mädchen vs. F. prausnitzii ). ); Acetat: p = 0,000005 (F. prausnitzii + D. Mädchen vs. D. Mädchen), p = 0,0000015 (F. prausnitzii vs. D. Mädchen), p = 0,012 (F. prausnitzii + D. Mädchen vs. F. prausnitzii ). ); Butyrat: p = 0,0000007 (F. prausnitzii + D. Mädchen vs. D. Mädchen), p = 0,0000007 (F. prausnitzii + D. Mädchen vs. F. prausnitzii); Die mM-Änderung auf der y-Achse zeigt den Unterschied zum beimpften Medium zu Beginn an. n = 3 unabhängige Experimente. ***p < 0,001, *p < 0,05, bestimmt durch zweiseitigen t-Test (a) oder einfaktorielle ANOVA (b). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt

Nach der Energetisierung der ruhenden Zellen mit Glucose (100 mM) erzeugten sowohl der Elternstamm F. prausnitzii DSM 32186 als auch der sauerstofftolerante DSM 32379 messbare Stromwellen, wenn Riboflavin (200 µM) zugesetzt wurde, wie zuvor für A2-16519 beschrieben.

Hauptkoordinatenanalyse für die Bray-Curtis-Unähnlichkeit, berechnet auf der Grundlage der Artenhäufigkeit für: a, Stuhlproben zu Studienbeginn (r2 = 0,018; p = 1; Adonis); b, Stuhlproben am Ende der Verabreichung (r2 = 0,040; p = 0,660; Adonis); c, Stuhlproben aus der Placebogruppe zu Studienbeginn (v2) und am Ende der Verabreichung (v5) (r2 = 0,009; p = 0,997; Adonis); d, Stuhlproben aus der Niedrigdosisgruppe zu Studienbeginn (v2) und am Ende der Verabreichung (v5) (r2 = 0,014; p = 0,971; Adonis); e, Stuhlproben aus der Hochdosisgruppe zu Studienbeginn (v2) und am Ende der Verabreichung (v5) (r2 = 0,001; p = 0,996; Adonis). Unterschiede in der Zusammensetzung wurden durch eine permutationelle multivariate ANOVA unter Verwendung der Adonis2-Funktion mit 10.000 Permutationen im veganen Paket in R (https://github.com/vegandevs/vegan/) getestet. Es wurden Anpassungen für mehrere Vergleiche vorgenommen. Die Punkte in den Diagrammen geben Stuhlproben der 43 Personen mit metagenomischen Daten an: Placebo, n = 13; niedrige Dosis, n = 16; hohe Dosis, n = 14. Die Analysen zeigen keinen Unterschied in der Mikrobiota-Zusammensetzung zwischen den Gruppen zu Studienbeginn oder am Ende der Verabreichung (Panels a bzw. b) und keinen Unterschied am Ende der Verabreichung im Vergleich zum Ausgangswert in allen der Gruppen (Panels c, d und e).

Änderung der relativen Häufigkeit in Proben mit hohem Ausgangswert von D. piger DSM 32187 (> 0,05 % der gesamten Mikrobiota; n = 4, p = 0,875, zweiseitiger Wilcoxon-Signed-Rank-Test) und niedrigem Ausgangswert von D. piger DSM 32187 (< 0,05). % der gesamten Mikrobiota; n = 10, p = 0,042, Wilcoxon-Signed-Rank-Test). v2, Stuhlproben zu Studienbeginn; v5, Stuhlprobe am Ende der Verabreichung. Bei Boxplots ist die Mittellinie der Median, die unteren und oberen Scharniere sind das erste und dritte Quartil, die Whiskers erstrecken sich vom Scharnier bis zum größten und kleinsten Wert nicht weiter als 1,5 × des Interquartilbereichs (IQR).

Schwefelwasserstoff wurde in Stuhlproben sowohl zu Beginn als auch am Ende der Verabreichung gemessen (40 Personen: Placebo, n = 12; niedrige Dosis, n = 16; hohe Dosis, n = 12; für eine Person war nicht ausreichend Material verfügbar). das Placebo und 2 in den Hochdosisgruppen). Es wurde ein zweiseitiger Wilcoxon-Signed-Rank-Test durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt

Ergänzende Informationen enthalten die Ergänzungstabellen 1–7, Versuchsdetails und einen statistischen Bericht.

Anzahl der Reads in fäkalen Metagenomen, die den genetischen Varianten zugeordnet sind, die den sauerstofftoleranten F. prausnitzii DSM 32379 charakterisieren.

Daten aus einer Maussicherheitsstudie

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Nachdrucke und Genehmigungen

Khan, MT, Dwibedi, C., Sundh, D. et al. Synergie und Sauerstoffanpassung für die Entwicklung von Probiotika der nächsten Generation. Natur (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06378-w

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Eingegangen: 30. Juni 2021

Angenommen: 27. Juni 2023

Veröffentlicht: 02. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06378-w

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