Übertragung von SARS

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4078 (2023) Diesen Artikel zitieren

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SARS-CoV-2 ist ein zoonotisches Virus mit dokumentierter bidirektionaler Übertragung zwischen Menschen und Tieren. Die Übertragung von SARS-CoV-2 vom Menschen auf freilebende Weißwedelhirsche (Odocoileus virginianus) stellt ein einzigartiges Risiko für die öffentliche Gesundheit dar, da sich möglicherweise Reservoirs bilden, in denen Varianten fortbestehen und sich entwickeln können. Wir haben zwischen November 2021 und April 2022 8.830 Atemwegsproben von freilebenden Weißwedelhirschen in Washington, DC und 26 Bundesstaaten der Vereinigten Staaten gesammelt. Wir haben 391 Sequenzen erhalten und 34 Pango-Abstammungslinien identifiziert, darunter Alpha, Gamma, Delta und Omicron Varianten. Evolutionsanalysen zeigten, dass diese Weißwedelhirschviren aus mindestens 109 unabhängigen Übertragungen vom Menschen stammten, was zu 39 Fällen einer anschließenden lokalen Übertragung von Hirsch zu Hirsch und drei Fällen einer möglichen Übertragung vom Weißwedelhirsch zurück auf den Menschen führte. Viren haben sich wiederholt an Weißwedelhirsche angepasst, wobei immer wieder Aminosäureaustausche zwischen Spike- und anderen Proteinen stattfanden. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass mehrere SARS-CoV-2-Linien eingeschleppt wurden, enzootisch wurden und bei Weißwedelhirschen gemeinsam zirkulierten.

Das schwere akute respiratorische Krankheitssyndrom Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) ist ein zoonotisches Virus1, das anderen Coronaviren mit hoher Konsequenz ähnelt, einschließlich des schweren akuten respiratorischen Syndroms-Coronavirus und des Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus2. Seit seinem Auftreten im Jahr 2019 hat sich SARS-CoV-2 rasant weiterentwickelt und zahlreiche genetische Varianten von SARS-CoV-2 hervorgebracht, darunter Variants of Concern (VOCs) Alpha, Beta, Gamma, Delta und Omicron3. Zusätzlich zum Menschen wurden SARS-CoV-2-Infektionen bei einer Vielzahl von Wild-, Haus- und exotischen Tieren in Gefangenschaft dokumentiert, wie z. B. Hirschen4, Nerzen5,6,7, Ratten8, Ottern, Frettchen, Hamstern, Gorillas und Katzen , Hunde, Löwen und Tiger9. Darüber hinaus wurde die Übertragung von SARS-CoV-2 von Tieren auf Menschen, obwohl sie nicht häufig vorkommt, bei Zuchtnerzen (Neogale vison)5, 6, Hauskatzen (Felis catus)10 und Weißwedelhirschen (Odocoileus virginianus) dokumentiert oder vermutet. 11, wobei Tiere als potenzielle Reservoire für sekundäre zoonotische Infektionen hervorgehoben werden. Ein Tierreservoir für SARS-CoV-2 bezieht sich auf einen Wirt, in dem das Virus heimlich zirkuliert, in der Population verbleibt und auf andere Tiere oder Menschen übertragen werden kann, was möglicherweise zu Krankheitsausbrüchen führt.

Weißwedelhirsche kommen sowohl in städtischen als auch ländlichen Gebieten Nordamerikas häufig vor. Schätzungsweise 30 Millionen Menschen leben in den gesamten Vereinigten Staaten (USA). Damas et al. (2020) zeigten einen hohen Grad an Sequenzidentität zwischen Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2)-Proteinen von Menschen und Weißwedelhirschen12, und experimentelle Infektionsstudien zeigten, dass das (Wuhan-Hu-1-Stamm)-ähnliche SARS-CoV-2-Virus dies kann infizieren leicht Weißwedelhirsche und führen zu einer hohen Virusausschüttung und einer Weiterverbreitung auf naive Artgenossen13,14,15. Chandler et al. Schätzungen zufolge waren 40 % der getesteten Weißwedelhirsche SARS-CoV-2 ausgesetzt, und zwar bereits im Januar 2020 in vier Bundesstaaten der USA16. Anschließend wurden aktive SARS-CoV-2-Infektionen, die durch den Nachweis der Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) nachgewiesen wurden, bei Weißwedelhirschen in den USA (d. h. Ohio4, Iowa17, Pennsylvania18, New York19) und in Ontario gemeldet , Kanada11. Die bisher bei Weißwedelhirschen gemeldeten Viren sind genetisch vielfältig, einschließlich der Pango-Linien20 B.1.2 und B.1.311 in Iowa (Probenahmezeitraum April 2020 bis Januar 2021)17, B.1.2, B.1.582, B.1.596 in Ohio (Januar bis März 2021)4, B.1.1.7 (Alpha), AY.88 (Delta), AY.5 (Delta) und AY.103 (Delta) in Pennsylvania (Januar bis November 2021)18, B .1, B.1.1, B.1.2, B.1.243, B.1.409, B.1.507, B.1.517, B.1.1.7 (Alpha), B.1.1.28 (Gamma), P.1 (Gamma ) und B.1.617.2 (Delta) in New York (September 2020 bis Dezember 2021)19 und B.1.641 (Dez 2021) in Ontario (November bis Dezember 2021)11. Interessanterweise waren die meisten dieser Weißwedelhirschviren genetisch mit denen verwandt, die gleichzeitig beim Menschen zirkulierten. Die Identifizierung genetisch sehr ähnlicher Viren bei mehreren Tieren, die an zwei verschiedenen Tagen am selben oder einem nahegelegenen Ort gefangen wurden, deutete darauf hin, dass SARS-CoV-2 wahrscheinlich innerhalb von Weißwedelhirschenpopulationen übertragen wurde4, 19. Epidemiologische Beweise für die mögliche Übertragung von SARS-CoV- 2 von Weißwedelhirschen auf Menschen in Kanada wurde berichtet11.

In dieser Arbeit präsentieren wir die Ergebnisse einer groß angelegten Überwachung auf SARS-CoV-2 in freilaufenden Weißwedelhirschenpopulationen in den USA. Unser Ziel bestand darin, die genetische Vielfalt von SARS-CoV-2 bei freilebenden Weißwedelhirschen zu verstehen, zu bewerten, ob das Virus in Weißwedelhirschenpopulationen zirkulierte, und die mit zoonotischen Infektionen verbundenen Übertragungshäufigkeiten zu bewerten. Insgesamt haben wir vom Spätherbst 2021 bis zum Frühjahr 2022 in Washington, D.C. und 26 Bundesstaaten der USA 8.830 Nasen- oder Mundabstriche von Weißwedelhirschen gesammelt, was 944 RT-PCR-positive Proben ergab. Davon wurden 391 sequenziert und mithilfe molekularer und evolutionärer Ansätze analysiert. Wir stellten fest, dass bei Weißwedelhirschen häufig mehrere SARS-CoV-2-Abstammungslinien eingeschleppt wurden, die anschließend enzootisch wurden und gemeinsam zirkulierten, und bestimmte Abstammungslinien blieben bei Weißwedelhirschen auch nach ihrem Rückgang in der menschlichen Population bestehen. Darüber hinaus wurden drei Fälle einer möglichen Übertragung von Weißwedelhirschen auf den Menschen identifiziert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Weißwedelhirsche möglicherweise als Reservoir für SARS-CoV-2 dienen und ein zoonotisches Risiko für den Menschen darstellen könnten. Im Kontext dieses Manuskripts bezieht sich der Begriff „Hirsch“ speziell auf Weißwedelhirsche.

Vom 4. November 2021 bis zum 4. April 2022 wurden insgesamt 8830 orale oder nasale Proben von Weißwedelhirschen aus Washington, D.C. und 26 US-Bundesstaaten, die an dieser Studie teilnahmen, gesammelt. SARS-CoV-2 wurde in 944 Proben durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) nachgewiesen (Abb. 1a). Wir haben virale Genome aus 391 Proben mit hochwertiger RNA sequenziert. Von diesen Sequenzen wurden in dieser Studie 383 aus 23 Staaten (Abb. 1b) mit vollständigen Metadaten verwendet, und 346 von ihnen hatten eine genomische Abdeckung von> 50% (Ergänzungsdaten 1). Insgesamt wiesen 282 Proben eine hohe Sequenzierungsabdeckung auf (d. h. > 95 % des Referenzgenoms) und wurden für weitere Evolutionsanalysen ausgewählt.

eine zeitliche Verteilung von SARS-CoV-2-positiven Nasenabstrichproben, die bei Weißwedelhirschen gesammelt wurden und für die Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS) ausgewählt wurden; b geografische Verteilung von SARS-CoV-2-positiven Weißwedelhirschproben mit WGS; c Genvarianten von SARS-COV-2 in Nasenabstrichproben von Weißwedelhirschen; d zirkulierende besorgniserregende SARS-CoV-2-Varianten (VOCs) bei Menschen in den Vereinigten Staaten (Januar 2021 – Oktober 2022) und solche, die vom 4. November 2021 bis 4. April 2022 bei Weißwedelhirschen beprobt wurden. Von 383 SARS- CoV-2 WGS mit vollständigen Metadaten (Supplementary Data 1), 355 hatten Pango-Abstammungslinien identifiziert, darunter 1 Nicht-VOC-Variante (B.1) und 354 VOCs (70 Alpha, 9 Gamma, 273 Delta, 2 Omicron); 282 hochwertige WGS wurden weiter in Evolutions- und Übertragungsanalysen verwendet. Der Pfeil wird verwendet, um die kleine Zahl in einer bestimmten Woche hervorzuheben. Beachten Sie, dass sich d) auf den VOC-Vergleich zwischen Menschen und Weißwedelhirschen konzentriert und am 1. Dezember 2021 in Pennsylvania eine einzelne Weißwedelhirschprobe entnommen wurde, die zu einer Nicht-VOC-Variante (B.1) gehört wurde in Panel d nicht angezeigt. Die Quelldaten für jedes Unterpanel sind in der Quelldatendatei verfügbar.

Durch die Pango-Abstammungszuordnung wurden 34 Abstammungslinien identifiziert, die zu B.1 und den vier VOCs Alpha (n = 70), Gamma (n = 9), Delta (n = 273) und Omicron (n = 2) gehören (Ergänzungsdaten 1). . Diese Pango-Abstammungslinien waren in den untersuchten Staaten weit verbreitet (Abb. 1c). Der Nordosten der USA, einschließlich Massachusetts (MA), New York (NY), New Jersey (NJ), Pennsylvania (PA) und West Virginia (WV), hatte die höchste Anzahl an Pango-Abstammungslinien. Alpha- und Delta-Varianten wurden während des gesamten Probenahmezeitraums bei Weißwedelhirschen nachgewiesen, während Gamma nur zu Beginn des Probenahmezeitraums (d. h. vom 20. November bis 2. Dezember 2021) und Omicron erst gegen Ende unseres Probenahmezeitraums (d. h , 24. Januar bis 11. Februar 2022) (Abb. 1d). Während des gesamten Probenahmezeitraums waren Delta und Omicron beim Menschen vorherrschend, Alpha und Gamma wurden jedoch selten gemeldet.

Insgesamt zirkulierten genetisch unterschiedliche SARS-CoV-2-Unterlinien von Alpha, Gamma, Delta und Omicron in den Weißwedelhirschpopulationen in mehreren geografischen Regionen der USA. Alpha und Gamma zirkulierten während des gesamten Untersuchungszeitraums in den US-amerikanischen Weißwedelhirschenpopulationen, obwohl beide Varianten beim Menschen selten geworden waren und durch neue Varianten (Delta und dann Omicron) verdrängt wurden.

Die Anzahl der wahrscheinlichen unabhängigen Spillover-Ereignisse von Menschen auf Weißwedelhirsche wurde ermittelt, indem für jede SARS-CoV-2-Sequenz von Weißwedelhirschen ein potenzieller Vorläufervirus beim Menschen identifiziert wurde. Wir haben ein potenzielles Vorläufervirus aus den GenBank-Datenbanken von GISAID (Global Initiative on Sharing All Influenza Data) und NCBI (National Center for Biotechnology Information) mit den ähnlichsten SARS-CoV-2-Genomen identifiziert, das im selben Bundesstaat vor der Verbreitung von Hirschen gesammelt wurde Beispielsammlung. Diese potenziellen Vorläuferviren wurden mit den SARS-CoV-2-Sequenzen des Weißwedelhirsches in phylogenetische Bäume integriert (Ergänzungsdaten 10) und bayesianische phylogenetische Analysen durchgeführt (Abb. 2a und Ergänzungsdaten 11). Die Spillover-Ereignisse wurden ermittelt und in drei Kategorien eingeteilt: Mensch-Hirsch (mindestens eine Vorläufer-Menschensequenz und eine einzelne Weißwedelhirsch-Sequenz), Mensch-Hirsch-Hirsch (mindestens eine Vorläufer-Menschensequenz und mindestens zwei Weißwedelhirsch-Sequenzen). Hirsch-Sequenzen von mehreren einzelnen Tieren) und Mensch-Hirsch-Mensch (mindestens eine menschliche Vorläufersequenz, mindestens zwei Weißwedelhirsch-Sequenzen von mehreren einzelnen Tieren und eine weitere menschliche Sequenz, die nach den Weißwedelhirsch-Sequenzen gesammelt wurde) (siehe Methoden).

a Der maximale Klade-Glaubwürdigkeitsbaum für SARS-CoV-2-Sequenzen von Weißwedelhirschen (n = 282) und ihre potenziellen Vorläuferviren beim Menschen ergab 109 unabhängige Spillover-Ereignisse von SARS-CoV-2 vom Menschen (direkt oder indirekt) auf Weißwedelhirsche. Schwanzhirsche (Ergänzungsdaten 2 und Ergänzungsdaten 11). Es wurden drei Arten von Spillover-Ereignissen identifiziert: Mensch-Hirsch (grün), wobei jedes Ereignis aus mindestens einer menschlichen Vorläufersequenz und einer Weißwedelhirsch-SARS-CoV-2-Sequenz besteht; Mensch-Hirsch-Hirsch (blau), wobei jedes Ereignis aus mindestens einer menschlichen Vorläufersequenz und mindestens zwei Weißwedelhirsch-SARS-CoV-2-Sequenzen besteht; Mensch-Hirsch-Mensch (rot), wobei jedes Ereignis aus mindestens einer menschlichen Vorläufersequenz, mindestens zwei Weißwedelhirschsequenzen und einer zusätzlichen menschlichen SARS-CoV-2-Sequenz besteht. Die Zeitskala des Stammbaums wurde in Jahreseinheiten dargestellt, und der Maßstabsbalken gibt die Divergenzzeit in Jahren an. b Die Anzahl der Spillover-Ereignisse nach besorgniserregender Variante. c Geografische Verteilung der Ereignisse Mensch-Hirsch, d Mensch-Hirsch-Hirsch und e Mensch-Hirsch-Mensch. Die Quelldaten für Teilpanel b–e sind in der Quelldatendatei verfügbar.

Von den 282 analysierten Weißwedelhirschviren wurden 238 in 109 Cluster gruppiert, die auch menschliche SARS-CoV-2-Viren enthielten. Für jeden Cluster wurde eine SARS-CoV-2-Genomsequenz von einem Menschen als Vorläufervirus mit einer Nukleotididentität von mindestens 99,85 % identifiziert, was auf mindestens ein unabhängiges Spillover-Ereignis vom Menschen auf Weißwedelhirsche hinweist (Abb. 2a, Ergänzende Daten). 11 und ergänzende Daten 2). Insgesamt wurden 109 unabhängige Spillover-Ereignisse identifiziert, wobei 106 ein menschliches SARS-CoV-2-Vorläufervirus aus demselben Bundesstaat betrafen und die restlichen drei ein menschliches SARS-CoV-2-Vorläufervirus betrafen, das von außerhalb des Staates stammte.

Von diesen 106 Spillover-Ereignissen innerhalb des Staates waren 64 Mensch-Hirsch-Ereignisse (60 Delta-, drei Alpha- und ein Omicron-Ereignisse), 39 waren Mensch-Hirsch-Hirsch-Ereignisse (29 Delta-, acht Alpha- und zwei Gamma-Ereignisse) und 3 waren Mensch-Hirsch-Hirsch-Ereignisse. Hirsch-Mensch-Ereignisse (alle Delta) waren weit über die untersuchten Staaten verteilt (Abb. 2a, b). Viren aus New York und New Jersey hatten die größte Anzahl von Spillover-Ereignissen zwischen Mensch, Hirsch und Hirsch (Abb. 2d). Neun von 39 Mensch-Hirsch-Hirsch-Spillover-Ereignissen enthielten mindestens fünf Sequenzen, wobei die größte 17 Sequenzen umfasste. Die Weißwedelhirsche-Sequenzen innerhalb jedes Mensch-Hirsch-Hirsch- oder Mensch-Hirsch-Mensch-Spillover-Ereignisses wiesen eine Sequenzidentität von mindestens 99,85 % auf. Interessant ist, dass die Sequenzen der Weißwedelhirsche, die innerhalb jedes Mensch-Hirsch-Hirsch-Spillover-Ereignisses gruppiert wurden, aus demselben Landkreis oder benachbarten Landkreisen stammen (ergänzende Abbildung 1); Bemerkenswert ist, dass alle Proben bei jedem Spillover-Ereignis innerhalb von drei Wochen entnommen wurden. Die drei Mensch-Hirsch-Mensch-Spillover-Ereignisse umfassten jeweils 11, sechs und zwei Weißwedelhirsche-Sequenzen, wobei alle Weißwedelhirsche-Sequenzen in jedem Spillover-Ereignis aus demselben oder benachbarten Landkreisen entnommen wurden.

Die drei anderen Spillover-Ereignisse (Ereignis Nr. 107–109 in den Zusatzdaten 2) betrafen menschliche SARS-CoV-2-Sequenzen außerhalb des Bundesstaates. Davon handelte es sich bei allen um Mensch-Hirsch-Ereignisse und gehörten zur Delta-Variante, an der VA (Mensch)-PA (Hirsch) (AY.25.1), OH (Mensch)-LA (Hirsch) (AY.119) und VA (Mensch) beteiligt waren )-WV (Hirsch) (AY.119) bzw. (Ergänzende Daten 11). Für unsere nachfolgenden Analysen haben wir uns nur auf die 106 Spillover-Ereignisse konzentriert, an denen innerstaatliche menschliche SARS-CoV-2-Sequenzen beteiligt waren.

Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die SARS-CoV-2-Viren bei Weißwedelhirschen durch mindestens 109 unabhängige direkte oder indirekte Spillover-Ereignisse von Menschen entstanden sind, wobei 106 menschliche SARS-CoV-2-Sequenzen innerhalb des Staates und drei außerhalb des Staates beteiligt waren menschliche SARS-CoV-2-Sequenzen. Diese Spillover-Effekte wurden in mehreren Bundesstaaten festgestellt und umfassten mehrere genetische Abstammungslinien, darunter die Alpha-, Gamma-, Delta- und Omicron-Varianten.

Um die Evolutionsmuster von SARS-CoV-2 nach der Einschleppung in Weißwedelhirsche aufzuklären, haben wir Aminosäuresubstitutionen bestimmt, indem wir die Sequenz(en) von Weißwedelhirschen in derselben Spillover-Gruppe mit dem potenziellen menschlichen Vorläufer verglichen haben. Bei den oben beschriebenen 106 Spillover-Ereignissen wurden insgesamt 833 Aminosäuresubstitutionen mindestens einmal identifiziert. Von diesen Substitutionen definierten wir wiederholte adaptive Aminosäuresubstitutionen als solche, die bei mindestens zwei Spillover-Ereignissen beobachtet wurden und nicht bei allen zuvor gesammelten menschlichen Viren desselben Staates in öffentlichen Datenbanken auftraten (Methoden). Insgesamt wurden 112 wiederholte Aminosäuresubstitutionen in mehreren viralen Proteinen beobachtet, überwiegend jedoch in den Proteinen ORF1a, ORF1b und S. Bei 58 dieser wiederholten Substitutionen wurde eine positive Selektion beobachtet, während bei nur einer von ihnen eine negative Selektion beobachtet wurde (Abb. 3a und ergänzende Daten 3). Diese 58 positiven Selektionssubstitutionen wurden über mehrere Abstammungslinien derselben VOC und über verschiedene VOCs hinweg nachgewiesen, und drei davon wurden bei mehr als 10 Spillover-Ereignissen beobachtet.

eine Anzahl wiederholter Aminosäuresubstitutionen in SARS-CoV-2-Proteinen; b Wiederholte Aminosäuresubstitutionen unter positiver Selektion und ihre Assoziation mit den in Abb. 2 gezeigten unabhängigen Übertragungsereignissen. Jede Zeile stellt ein Übertragungsereignis dar, und ein rotes Kästchen in jeder Spalte stellt eine adaptive Substitution dar, die bei einem bestimmten Ereignis (Zeile) beobachtet wurde. Ergänzende Daten 2 und ergänzende Daten 11 enthalten eine Liste der Spillover-Ereignisse. Weitere Informationen zu Aminosäuresubstitutionen finden Sie in den Zusatzdaten 3. Die Quelldaten für jedes Unterpanel sind in der Quelldatendatei verfügbar.

Von diesen wiederholten Substitutionen wurden 27 im Nichtstrukturprotein (NSP) 3 beobachtet, das das größte SARS-CoV-2-Protein ist und als Teil des NSP3-4-6-Komplexes an der Virusreplikation beteiligt ist; Dieser Komplex fungiert auch bei der Modifikation des endoplasmatischen Retikulums und der Bildung von Doppelmembranvesikeln in der Papain-ähnlichen Proteasedomäne21, 22. Diese Substitutionen waren hauptsächlich in Ubl1, der sauren Domäne und Mac1 verteilt, die mit der Bindung und Interaktion einzelsträngiger RNA zusammenhängen das Nukleokapsid (N)-Protein und die Bindung von ADP-Ribose oder Poly(ADP-Ribose)21 (Abb. 4a). Mehrere wiederholte Substitutionen wurden in NSP7, NSP8 und NSP12 beobachtet, die einen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp)-Komplex bilden, der die Synthese viraler RNA23 katalysiert; Die meisten dieser Substitutionen befanden sich außerhalb der RdRp-Struktur, einschließlich einer in der Nukleotidyltransferase (NiRAN)-Domäne24, aber keine wurde an oder in der Nähe von enzymatischen Stellen beobachtet (z. B. Finger, Handfläche und Daumen von NSP12)25 (Abb. 4b). Darüber hinaus wurden 18 wiederholte Substitutionen im Spike-Protein beobachtet, davon acht in der N-terminalen Domäne, eine in den Subdomänen 1 und 2 und eine in der Heptapeptid-Wiederholungssequenzdomäne (HR2) (Abb. 4c). Überraschenderweise wurden in der RBD-Domäne von Spike keine wiederholten Substitutionen beobachtet.

a Papain-ähnliche Proteinase (Nichtstrukturprotein 3 [NSP3]; Matrize mit Protein Data Bank [PDB]-Zugangsnummer 6wuu), b RNA-abhängige RNA-Polymerase (NSP7, NSP8 und NSP12; Matrize mit PDB #6m71) und c-Spike-Protein (Vorlage mit PDB #6vxx). Die Strukturen wurden mit PyMOL visualisiert. Weitere Ersetzungen sind in den Zusatzdaten 3 aufgeführt. Die Quelldaten für die Balkenfigur in Teilpanel a sind in der Quelldatendatei verfügbar.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich SARS-CoV-2 schnell und wiederholt an Weißwedelhirsche angepasst hat, mit wiederkehrenden und positiv ausgewählten Aminosäuresubstitutionen im Spike-Protein (jedoch nicht im RBD), in der Replikase und in anderen Proteinen.

Um weiter zu beurteilen, ob sich SARS-CoV-2 unter Weißwedelhirschen ausbreitet und bei Weißwedelhirschen enzootisch geworden ist, haben wir auch die Seroprävalenz im Bundesstaat New York (NY) untersucht, einem Bundesstaat mit einer der höchsten Zahlen an Nasalhirschen /Mundabstriche und Serumproben verfügbar sowie konsistente und anhaltende SARS-CoV-2-Positivität im qRT-PCR-Screening. Insgesamt haben wir Nasen-/Mundabstrich- und/oder Serumproben von 987 einzelnen Tieren in 38 Landkreisen entnommen. Von ihnen hatten 790 Tiere gepaarte Abstrich- und Serumproben, 68 hatten nur Abstrichproben und 129 hatten nur Serumproben (Ergänzungsdaten 4).

Die Ergebnisse des qRT-PCR-Screenings zeigten, dass 184 Tiere (21,45 %) positiv auf SARS-CoV-2 waren, wobei positive Proben aus der Hälfte der 38 untersuchten Landkreise stammten (Abb. 5a). Für die sechs Kreise mit \(\ge\)50 Tieren lag die qRT-PCR-Positivität auf Kreisebene zwischen 8,70 und 62,50 %. Im Vergleich dazu zeigten die Ergebnisse des Surrogatvirus-Neutralisationstests (sVNT), dass 332 Tiere (36,12 %) seropositiv für SARS-CoV-2 waren und 22 untersuchte Landkreise abdeckten (Abb. 5a). Für fünf Kreise mit \(\ge\)50 Tieren lag die Seropositivitätsrate auf Kreisebene zwischen 5,26 % und 55,77 %. Die höhere Antigenprävalenz des Virus in Nasenabstrichen im Vergleich zur Seroprävalenz deutete auf aktive Ausbrüche bei Weißwedelhirschen während des Probenahmezeitraums hin.

eine landesspezifische positive Rate durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) oder Ersatzvirus-Neutralisationstest (sVNT) in New York, wobei nur die Bezirke mit mindestens vier Proben einbezogen wurden; b der maximale Klade-Glaubwürdigkeitsbaum der SARS-CoV-2-Viren von Weißwedelhirschen in New York mit sechs Übertragungsereignissen, wobei mindestens vier Hirschsequenzen erkannt wurden; c Übertragungsereignisse von SARS-CoV-2-Viren in New York, analysiert mit der Bayesian Stochastic Search Variable Selection-Methode; d die maximalen Clade-Glaubwürdigkeitsbäume von SARS-CoV-2-Viren des Weißwedelhirsches, die mit Übertragungsereignissen zwischen Landkreisen (Fall Nr. 1–4, in Orange) und innerhalb des Landkreises (Fall Nr. 5–6 in Rosa) verbunden sind, die mithilfe von erkannt wurden Phylogeographische Analysen. Die Bayes-Faktoren für diese landesweiten Übertragungsereignisse sind in den Zusatzdaten 5 aufgeführt. Die roten Knoten waren SARS-CoV-2-Sequenzen von Weißwedelhirschen und die cyanfarbenen Knoten stammten von Menschen. Die Quelldaten für Panel a sind in Supplementary Data 4 und der Quelldatendatei verfügbar.

Von 790 Tieren mit gepaarten nasalen/oralen Abstrichen und Serumproben aus New York waren 101 sowohl im qRT-PCR- als auch im sVNT-Test SARS-CoV-2-positiv, 60 nur im qRT-PCR-Test und 168 nur im sVNT-Test. Es wurde davon ausgegangen, dass ein Tier SARS-CoV-2 ausgesetzt war, wenn der Test entweder durch qRT-PCR oder sVNT positiv war, was dazu führte, dass 415 von 987 (42,05 %) einzigartigen Tieren, die aus New York beprobt wurden, SARS-CoV-2 ausgesetzt waren. 2.

Um die Übertragungsmuster zwischen freilaufenden Weißwedelhirschen zu verstehen, führten wir Bayesian Stochastic Search Variable Selection (BSSVS)-Analysen der NY-Viren aus sechs genetischen Clustern durch, von denen jeder mindestens vier Weißwedelhirsche-Infektionen umfasste (Abb. 5c). ). Die Ergebnisse zeigten, dass sich Viren in vier Clustern über benachbarte Landkreise ausbreiteten und die Viren in zwei Clustern auf denselben Landkreis beschränkt waren (Ergänzungsdaten 5).

Zusammenfassend zeigten unsere Ergebnisse, dass SARS-CoV-2-Viren in freilebenden Weißwedelhirschpopulationen enzootisch waren und eine aktive Übertragung zwischen Populationen auf lokaler Ebene erfolgte.

Unsere phylogenetische Analyse identifizierte drei Cluster mit potenziellen sekundären zoonotischen Übertragungsereignissen, zwei in NC und einen in MA (Abb. 2a, Cluster Mensch-Hirsch-Mensch). Wir führten zusätzliche Analysen durch, die zeigten, dass die Nukleotidsequenz eines SARS-CoV-2 aus einem menschlichen Fall in North Carolina zu 99,93 % mit den Viren von Weißwedelhirschen in North Carolina (Abb. 6a und 7), einem anderen SARS-CoV, identisch war -2 aus einem menschlichen Fall in North Carolina war zu 99,94 % identisch mit den Viren von Weißwedelhirschen in North Carolina (Abb. 8). Die beiden SARS-CoV-2-Sequenzen von zwei menschlichen Fällen in MA waren zu 99,96 % identisch mit denen von Weißwedelhirschen in MA (Abb. 9).

a Der maximale Clade-Glaubwürdigkeitsbaum, der die genetische Beziehung zwischen den SARS-CoV-2-Sequenzen des Weißwedelhirsches und denen beim Menschen sowie dem möglicherweise vom Weißwedelhirsch stammenden menschlichen Virus veranschaulicht, ist eingerahmt. Das Vorhandensein von Weißwedelhirsch-spezifischen, wiederholt adaptiven Aminosäuresubstitutionen wurde für jeden Knoten im Baum rot markiert. Die roten Knoten waren SARS-CoV-2-Sequenzen von Weißwedelhirschen, die grünen von Menschen und die blauen von Zoolöwen. Die Zeitskala des Stammbaums wurde in Jahreseinheiten dargestellt, und der Maßstabsbalken gibt die Divergenzzeit in Jahren an. b Häufigkeit der beiden Weißwedelhirsch-spezifischen wiederholt adaptiven Substitutionen in den Weißwedelhirsch- oder menschlichen SARS-CoV-2-Sequenzen in öffentlichen Datenbanken. Offener ORF-Leserahmen, S-Spike-Protein und nichtstrukturelles NSP-Protein. Die Quelldaten für Unterpanel b sind in der Quelldatendatei verfügbar.

a Der maximale Clade-Glaubwürdigkeitsbaum, der die genetische Beziehung zwischen den SARS-CoV-2-Sequenzen von Weißwedelhirschen und denen von Menschen sowie der menschlichen SARS-CoV-2-Sequenz, die möglicherweise von Weißwedelhirschen stammt, veranschaulicht, ist eingerahmt; Die genomische Diversität (im Vergleich zu Wuhan-Hu-1/2019) und das Vorhandensein von zwei Weißwedelhirsch-spezifischen wiederholten Aminosäuresubstitutionen sowie einer ereignisspezifischen Aminosäuresubstitution (geteilt durch blaue Linie) wurden jeweils rot markiert Knoten im Baum. Die Zeitskala des Stammbaums wurde in Jahreseinheiten dargestellt, und der Maßstabsbalken gibt die Divergenzzeit in Jahren an. b Häufigkeit der drei Weißwedelhirsch-spezifischen Substitutionen in den Weißwedelhirsch- oder menschlichen SARS-CoV-2-Sequenzen. Die roten Knoten waren SARS-CoV-2-Sequenzen von Weißwedelhirschen, die grünen von Menschen und die blauen von Zoolöwen. Wir analysierten die 12 Weißwedelhirsche-Sequenzen auf Einzelnukleotidvariationen zwischen Wirten (iSNVs) und definierten ein geringfügiges iSNV mit einer Prävalenz von mindestens 5 %, aber weniger als 50 % unter den Lesevorgängen. Unter diesen 12 Proben identifizierten wir ein einzelnes iSNV in 22-002350-031_NC_Randolph_2021-11-20_AY.103, nämlich ORF1b:V12271L mit 461 Lesevorgängen, die für die Aminosäure L kodierten (39,6 %) und 703 Lesevorgängen, die für die Aminosäure L kodierten (60,4 %). an dieser Stelle. Die Quelldaten für Unterpanel b sind in der Quelldatendatei verfügbar.

Der maximale Clade-Glaubwürdigkeitsbaum, der die genetische Beziehung zwischen den SARS-CoV-2-Sequenzen des Weißwedelhirsches und denen beim Menschen sowie dem möglicherweise vom Weißwedelhirsch stammenden menschlichen Virus veranschaulicht, ist eingerahmt. Die genomische Diversität (im Vergleich zu Wuhan-Hu-1/2019) und das Vorhandensein von drei Weißwedelhirsch-spezifischen wiederholten Aminosäuresubstitutionen (Stern markiert diejenige unter positiver Auswahl) wurde für jeden Knoten im Baum rot markiert. Keine menschlichen SARS-CoV-2-Viren (außer dem im Kasten aufgeführten) aus öffentlichen Datenbanken enthalten die Kombination dieser drei für Weißwedelhirsche spezifischen wiederholten Aminosäuresubstitutionen. Die Knoten in Rot waren SARS-CoV-2-Sequenzen von Weißwedelhirschen und die in Cyan von Menschen. Die Zeitskala des Stammbaums wurde in Jahreseinheiten dargestellt, und der Maßstabsbalken gibt die Divergenzzeit in Jahren an.

In den menschlichen SARS-CoV-2-Viren im Kasten wurden drei für Weißwedelhirsche spezifische Polymorphismen identifiziert. Keine menschlichen SARS-CoV-2-Viren (außer dem in der Box aufgeführten) aus öffentlichen Datenbanken enthalten die Kombination dieser drei Polymorphismen. Die Häufigkeit jedes der drei einzelnen Polymorphismen in anderen menschlichen SARS-CoV-2-Viren ist in den Zusatzdaten 7 aufgeführt. Die roten Knoten waren SARS-CoV-2-Sequenzen von Weißwedelhirschen und die in Cyan vom Menschen. Die Zeitskala des Stammbaums wurde in Jahreseinheiten dargestellt, und der Maßstabsbalken gibt die Divergenzzeit in Jahren an.

Um zu beurteilen, ob es sich hierbei um potenzielle Spillback-Ereignisse handelte, identifizierten wir an Weißwedelhirsche angepasste Sequenzen mithilfe der oben genannten wiederholten Aminosäuresubstitutionen (Abb. 3) und untersuchten weiter, ob sich von Weißwedelhirschen erworbene Substitutionen möglicherweise auf den Menschen ausgeweitet haben. Vierzehn wiederholte Aminosäuresubstitutionen wurden in Weißwedelhirschsequenzen aus einem phylogenetischen Cluster NC AY.103 Mensch-Hirsch-Mensch beobachtet (Ereignis Nr. 24 in Ergänzungsdaten 2). Darunter wurden zwei positiv adaptive Substitutionen von Weißwedelhirschen, S:S680F und ORF1a:T2283I (im Protein NSP3), in einer einzigen menschlichen SARS-CoV-2-Sequenz beobachtet (GSAID-Zugangsnummer: EPI_ISL_9246286, Virusname: NC-CORVASEQ). -1086-651) (Abb. 6a). Die Häufigkeit jeder der beiden Substitutionen war in anderen humanen SARS-CoV-2-Sequenzen vernachlässigbar, in Sequenzen von Weißwedelhirschen jedoch hoch (Abb. 6b). Drei weitere für Weißwedelhirsche spezifische Substitutionen (d. h. ORF1a:S443P [NSP2], ORF1b:V1271L [NSP 13] und ORF1a:T1678A [NSP 3]) wurden in der menschlichen NC-CORVASEQ-1086-651-Sequenz beobachtet selten in menschlichen AY.103-Sequenzen (Abb. 7 und ergänzende Daten 6). Keine anderen menschlichen SARS-CoV-2-Viren aus öffentlichen Datenbanken enthalten die Kombination dieser fünf für Weißwedelhirsche spezifischen Substitutionen (Ergänzungsdaten 6).

Die Sequenzen von Menschen und Weißwedelhirschen im NC AY.44-Ereignis „Mensch-Hirsch-Mensch“ (Ereignis Nr. 40 in den Zusatzdaten 2) wiesen eine Kombination aus drei weißwedelhirschspezifischen wiederholten Substitutionen auf (S:D936H, ORF8:K68E). und N:T379I), die in keiner anderen menschlichen Sequenz in öffentlichen Datenbanken nachgewiesen wurden (Abb. 8). In ähnlicher Weise hatten die Sequenzen von Mensch und Weißwedelhirsch im MA AY.119-Mensch-Hirsch-Mensch-Ereignis (Ereignis Nr. 65 in den Zusatzdaten 2) eine Kombination aus drei SNPs (d. h. C7303T, C21459T und C26469T). nicht in anderen menschlichen SARS-CoV-2-Sequenzen in öffentlichen Datenbanken identifiziert (Abb. 9 und ergänzende Daten 7).

Um festzustellen, ob eine der weißwedelhirschspezifischen wiederholten Aminosäuresubstitutionen als intrawirtsspezifische Einzelnukleotidvariationen (iSNVs) in menschlichen SARS-CoV-2-Viren vorhanden sein könnte, haben wir die Minderheits-iSNVs in 148 menschlichen SARS-CoV-Viren analysiert -2 Viren, die wir aus Missouri sequenziert haben und die zu denselben AY.103-, AY.119- und AY.44-Linien gehören wie unsere Mensch-Hirsch-Mensch-Ereignisse (Ergänzungsdaten 8). Ein Minderheits-iSNV wurde definiert, wenn die Häufigkeit eines Allels bei den Reads mindestens 5 %, aber weniger als 50 % betrug. Wir haben das Fehlen jeglicher SNVs an den Stellen bestätigt, an denen wir weißwedelhirschespezifische wiederholte Aminosäureaustausche in den Mensch-Hirsch-Mensch-Ereignissen festgestellt haben.

Zusammenfassend deuten unsere Analysen auf drei mögliche Spillover-Fälle von SARS-CoV-2-Viren des Weißwedelhirsches auf den Menschen hin, wobei weißwedelhirschespezifische Aminosäuresubstitutionen oder SNPs auf den Menschen übertragen werden.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass SARS-CoV-2 in fast der Hälfte der US-Bundesstaaten bei freilebenden Weißwedelhirschen als enzootisch nachgewiesen wurde. Es wurden sequenzierte Viren der Alpha-, Gamma-, Delta- und Omicron-Linien identifiziert (Abb. 1c), obwohl in diesem Probenahmezeitraum hauptsächlich Delta und Omicron in der menschlichen Bevölkerung zirkulierten. Die SARS-CoV-2-Abstammungslinien waren auch Monate nach dem Rückgang dieser Abstammungslinien in der menschlichen Bevölkerung noch bei Weißwedelhirschen vorhanden (Abb. 1d). Diese Ergebnisse stimmten mit einem früheren Bericht überein, der zeigte, dass zwei Weißwedelhirsche Mitte November, sechs bis sieben Monate nach der Alpha-Welle beim Menschen, mit der Alpha-Variante infiziert wurden18. In einer anderen Studie haben Caserta et al. entdeckte Alpha- und Gammaviren bei New Yorker Weißwedelhirschen zwischen Oktober und Dezember 2021, nachdem diese VOCs beim Menschen durch Delta und Omicron ersetzt wurden, und entdeckte zwischen Oktober und November 2021 Deltaviren bei New Yorker Weißwedelhirschen, während der Delta-Zeit und Omicron waren beim Menschen vorherrschend19. Darüber hinaus umfassten die in dieser Studie identifizierten Abstammungslinien auch solche, die Ende 2021 oder 2022 in den USA auftauchten und sich mit unserem Stichprobenzeitraum überschnitten. Insgesamt zeigte diese Studie, dass es weiterhin zu einer häufigen Einschleppung neuer menschlicher Viren in freilebende Weißwedelhirsche kam und dass SARS-CoV-2-VOCs in der Lage waren, in Weißwedelhirschen fortzubestehen, selbst nachdem diese Varianten beim Menschen selten geworden waren Bevölkerung.

Unsere Analysen legten nahe, dass die Viren von Weißwedelhirschen im Vergleich zu denen von Menschen eine hohe genetische Identität aufwiesen und es mindestens 109 unabhängige Spillover-Ereignisse vom Menschen auf Weißwedelhirsche gab (Abb. 2a). Angesichts der großen Häufigkeit von Weißwedelhirschen in den USA und ihrer Verbreitung in ländlichen, vorstädtischen und städtischen Umgebungen kommt es häufig zu direkten und indirekten Interaktionen zwischen Menschen und Weißwedelhirschen. Beispielsweise war die zusätzliche Fütterung von Weißwedelhirschen eine häufige Ursache für Interaktionen zwischen Menschen und Weißwedelhirschen und erleichtert nachweislich die Übertragung von Rindertuberkulose bei freilebenden Weißwedelhirschen in Michigan26. Angesichts der sehr häufigen Einschleppung von menschlichem SARS-CoV-2 in Weißwedelhirsche bleiben sowohl direkte als auch indirekte Übertragungswege plausibel. Weitere Studien sind erforderlich, um Wechselwirkungen zu charakterisieren und zu identifizieren, die möglicherweise zu einer Übertragung zwischen Menschen und Weißwedelhirschen führen können. Eine virale Einschleppung von Weißwedelhirschen könnte durch den Kontakt mit kontaminierten Umgebungen und Infektionsherden (z. B. kontaminierte menschliche Lebensmittelabfälle, Masken und andere Abfallprodukte) oder durch direkte Interaktionen mit anderen Tierwirten erfolgen. Weißwedelhirsche haben direkte und indirekte Interaktionen mit mehreren anderen Tierarten (z. B. Rotfuchs, Stinktiere und andere Nagetiere), die anfällig für eine Infektion mit SARS-CoV-227,28,29,30 sind.

Seit seiner Entstehung hat sich SARS-CoV-2 in der menschlichen Bevölkerung rasch weiterentwickelt. Das Virus hat eine Reihe von Aminosäureaustauschen im Spike und anderen Proteinen erworben. Von diesen Substitutionen betrafen einige bedeutende die Spike-RBD-Domäne und führten zu Viren mit erhöhter Rezeptorbindung an menschliche ACE2-Rezeptoren31 und verbesserter Fähigkeit, neutralisierenden Antikörpern zu entgehen32. Darüber hinaus wurden auch Substitutionen in anderen Proteinen wie dem Nukleoprotein (z. B. NP:R203K/G204R) beobachtet, die aufgrund der zusätzlichen basischen Aminosäuren die lokale positive Ladung erhöhen können, um die RNA-Bindung und die RNP-Assemblierungseffizienz zu erhöhen33. In dieser Studie haben wir 112 wiederkehrende Aminosäuresubstitutionen in Viren von Weißwedelhirschen identifiziert, von denen 58 einer positiven Selektion unterzogen wurden, was darauf hindeutet, dass sich die Viren an Weißwedelhirsche anpassten. Allerdings wurden weder an den RBD- noch an den Polymerase-Enzymstellen Substitutionen beobachtet, was darauf hindeutet, dass RBD und Polymerase wahrscheinlich bereits für Weißwedelhirsche geeignet waren. Die Rolle dieser wiederkehrenden Substitutionen bei der Anpassung an Weißwedelhirsche muss weiter untersucht werden.

Wir untersuchten weiter, ob die 58 an Weißwedelhirsche angepassten Substitutionen in immunogenen Regionen von SARS-CoV-2 lagen und ob sie sich mit etwaigen bei anderen Tieren oder Menschen identifizierten Substitutionen überschnitten. Da unser Verständnis der Weißwedelhirsch-spezifischen T-Zell- und B-Zell-Epitope derzeit begrenzt ist, haben wir untersucht, ob die Weißwedelhirsch-adaptiven Substitutionen innerhalb menschenspezifischer T-Zell- und B-Zell-Epitope von SARS lokalisiert sind. CoV-2, die in der Immune Epitope Database (https://www.iedb.org) kuratiert wurden. Unsere Analyse ergab, dass 51 der 58 an Weißwedelhirsche angepassten Substitutionen in gemeldeten menschlichen T-Zell- (n = 9) oder B-Zell-Epitopen (n = 42) von SARS-CoV-2 lagen (Supplementary Data 9). . Das Übergreifen dieser an Weißwedelhirsche angepassten Stämme zurück auf den Menschen birgt das Potenzial, die Wirksamkeit der bereits bestehenden Immunität zu untergraben, die mit diesen Epitopen verbunden ist, die durch frühere SARS-CoV-2-Infektionen und/oder Impfungen in der menschlichen Bevölkerung entstanden sind. Dennoch sind weitere Untersuchungen erforderlich, um den Zusammenhang zwischen der adaptiven Bedeutung dieser Substitutionen und der Herdenimmunität von Weißwedelhirschen zu verstehen.

Im Gegensatz zu Weißwedelhirschen berichtete eine Studie an Nerzen über vier Substitutionen (L452M, Y453F, F486L, N501T) im Spike-Protein während eines SARS-CoV-2-Ausbruchs auf einem niederländischen Bauernhof34, und drei dieser Stellen (Y453F, F486L , N501T) wurden wiederholt bei Nerzausbrüchen beobachtet35. Bashor et al.36 identifizierten 7 SNVs (H69R, D215H, D215N, N501T, D614G, H655Y und S686G in Spike und L37F in ORF1a), die als besorgniserregende Varianten bei Menschen oder anderen Arten wie Katzen und Hunden gemeldet wurden , Hamster und Frettchen. Adaptive Mutationen wurden in diesen Varianten auf mehreren Wirten beobachtet. Allerdings gehörten diese Standorte nicht zu denen, die wir bei Weißwedelhirschen identifizierten. Darüber hinaus verglichen wir die positiven Selektionsstellen bei Weißwedelhirschen mit denen beim Menschen37,38,39 und stellten fest, dass sich keine überlappte. Daher waren die adaptiven Substitutionen, die wir in dieser Studie identifizierten, wahrscheinlich spezifisch für Weißwedelhirsche und könnten innerhalb der Hirschpopulation als Folge des selektiven Drucks auf das Virus entstanden sein.

Durch die Integration serologischer und molekularer Daten zeigten wir, dass etwa 42 % der Weißwedelhirsche in New York SARS-CoV-2 ausgesetzt waren (Abb. 5a; Zusatzdaten 4). Übertragungsereignisse wurden innerhalb und zwischen Landkreisen anhand phylogeografischer Analysen identifiziert (Abb. 5b, c), was stark darauf hindeutet, dass eine aktive Übertragung bei Weißwedelhirschen stattgefunden hat. Interessant ist, dass 101 Weißwedelhirsche sowohl im qRT-PCR- als auch im sVNT-Test seropositiv waren, was in den späten Stadien der Infektion in experimentellen Infektionsstudien mit Weißwedelhirschen beobachtet wurde13, 14. In diesen Studien wurde gezeigt, dass Weißwedelhirsche seropositiv waren werden nichtinfektiös, sobald neutralisierende Antikörpertiter nachweisbar sind.

Eine effiziente Übertragung von Hirsch zu Hirsch könnte die Etablierung von Weißwedelhirschen als Reservoir für SARS-CoV-2 erleichtern, was ein kontinuierliches Risiko einer zoonotischen Übertragung zurück auf Menschen und andere Tiere birgt. Die Abstammungslinien mit weißwedelhirschenadaptiven Mutationen können das Risiko für den Menschen weiter erhöhen. Darüber hinaus kann die Übertragung älterer SARS-CoV-2-Viren vom Weißwedelhirsch auf Menschen, die heute in der menschlichen Bevölkerung selten vorkommt, ein größeres Risiko darstellen, da die Immunität gegen diese Abstammungslinien nachlässt40, 41. Unsere Ergebnisse verdeutlichen die möglichen Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit Übertragung von Weißwedelhirschen auf den Menschen, es sind jedoch weitere Studien mit größeren Stichproben erforderlich, um das Ausmaß der Übertragung und die damit verbundenen Risiken für die menschliche Gesundheit vollständig zu verstehen.

Ähnliche zoonotische Übertragungsereignisse wurden bei menschlichen saisonalen H3N2-Influenza-A-Viren dokumentiert, die in den 1990er Jahren vom Menschen auf Schweine übersprangen42 und die Entstehung des Pandemievirus von 2009 durch genetische Neuordnung mit heutigen menschlichen, Vogel- und Schweine-Influenzaviren erleichterten43. Die Schweine-H3N2-Variante (H3N2v) war in den 1990er Jahren antigenisch den menschlichen H3N2-Vorläuferviren ähnlicher, nicht aber den heutigen saisonalen H3N2-Viren beim Menschen44. Seit 2011 wurde dieses H3N2v-Virus häufig auf den Menschen zurückübertragen und verursachte 439 bestätigte Infektionen, insbesondere bei Personen, die nach dem Jahr 2000 geboren wurden und diesem Virussubtyp noch nicht ausgesetzt waren45.

Kürzlich wurde in Kanada ein sekundärer Zoonosefall gemeldet, der mit einer sehr unterschiedlichen Abstammungslinie in Zusammenhang stand, die vom Weißwedelhirsch stammt11. Um zu testen, ob es in unseren Proben zu sekundären Zoonoseereignissen kam, haben wir die SARS-CoV-2-Sequenzen unserer Weißwedelhirsche und alle menschlichen SARS-CoV-2-Sequenzen in öffentlichen Datenbanken umfassend verglichen. Wir haben drei potenzielle Fälle von umgekehrter Zoonose in zwei US-Bundesstaaten identifiziert. Eine retrospektive epidemiologische Untersuchung wurde durchgeführt, um festzustellen, ob die fünf Personen, die mit dem AY.103-Mensch-Hirsch-Mensch-Ereignis in North Carolina in Verbindung gebracht wurden, das auch drei SARS-CoV-2-Sequenzen von Zoolöwen umfasste (Abb. 6a), Kontakt mit Hirschen hatten im Monat vor der damit verbundenen Erkrankung an COVID-19. Wir konnten drei Personen erfolgreich kontaktieren, aber keine berichtete von engem Kontakt mit Hirschen oder dem Zoo. Dennoch wiesen die Viren in den menschlichen Fällen aller drei von uns entdeckten Übertragungsereignisse von Hirschen auf Menschen Weißwedelhirsch-spezifische Aminosäuresubstitutionen oder SNPs auf, die in anderen menschlichen SARS-CoV-2-Genomen vernachlässigbar beobachtet wurden. Der Rückschluss auf eine sekundäre Zoonose aus einem Stammbaum ist durch die verfügbaren Sequenzdaten begrenzt. Derzeit liegen nur wenige Informationen darüber vor, wie oft infizierte Menschen mit Weißwedelhirschen in Kontakt kommen oder umgekehrt und wie wahrscheinlich es unter diesen Umständen zu einer artübergreifenden Übertragung kommt. Insgesamt verdeutlichen diese potenziellen Fälle die Möglichkeit einer bidirektionalen Übertragung von SARS-CoV-2 an der Schnittstelle zwischen Mensch und Weißwedelhirsch.

Eine Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass den menschlichen SARS-CoV-2-Daten aus öffentlichen Datenbanken die geografische Granularität fehlt und sie möglicherweise nicht die Gebiete abdecken, in denen unsere Weißwedelhirschproben gesammelt wurden, obwohl über 14 Millionen Genomsequenzen in unsere Analysen einbezogen wurden. Beispielsweise gab es unter 282 SARS-CoV-2-Sequenzen von Weißwedelhirschen 18, bei denen wir keine genetisch ähnlichen menschlichen SARS-CoV-2-Sequenzen im selben Zustand wie das potenzielle Vorläufervirus identifizieren konnten (Abb. 2a). Diese Studie weist auch eine Einschränkung auf, da die Anzahl der Proben, die an derselben Probenahmestelle entnommen wurden, begrenzt war und sich typischerweise über einen Zeitraum von weniger als zwei Wochen erstreckte. Diese begrenzte Probenahmedauer hinderte uns daran, die Dauer und Populationsdynamik jeder SARS-CoV-2-Variante in der Weißwedelhirschpopulation vollständig zu verstehen. Um die Übertragungsmuster von SARS-CoV-2 bei Weißwedelhirschen und zwischen Menschen und Weißen weiter aufzuklären, sind weitere Untersuchungen zur Analyse der über einen längeren Zeitraum im selben geografischen Gebiet gesammelten Viren von Weißwedelhirschen und menschlichen SARS-CoV-2 erforderlich -tailed Hirsch.

Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass SARS-CoV-2 bei Weißwedelhirschen enzootisch war und dass die bei Weißwedelhirschen zirkulierenden Viren auf häufige und unabhängige Spillover-Ereignisse beim Menschen zurückzuführen sind, bei denen mehrere genetische Abstammungslinien unter Weißwedelhirschen gemeinsam zirkulieren , einschließlich Abstammungslinien, die vor und während unseres Probenahmezeitraums beim Menschen beobachtet wurden. Eine fortgesetzte groß angelegte Überwachung von Weißwedelhirschen ist notwendig, um die Entwicklung und Verteilung genetischer Varianten bei Weißwedelhirschen zu verstehen und zu bewerten, ob die Weißwedelhirsche ein potenzielles Reservoir für SARS-CoV-2-Viren sind und welche Rolle diese spielen Weißwedelhirsch in der Ökologie und Naturgeschichte von SARS-CoV-2.

Weißwedelhirsche wurden im Rahmen einer Vereinbarung zur Bewältigung von Wildtierschäden gefangen, die von USDA/APHIS Wildlife Services verwaltet wird. Die Probenentnahme erfolgte opportunistisch in Zusammenarbeit mit Aufsichtsbehörden und im Rahmen routinemäßiger Überwachungsprogramme. Geschlecht und Geschlecht wurden in dieser Studie nicht ausgeschlossen. Diese Studie konzentriert sich auf die virale Evolution und Übertragung und beinhaltete keine Analyse des Wirtsgeschlechts und -geschlechts.

Um die Intra-Wirt-Intra-Wirt-Einzelnukleotidvariationen zwischen menschlichen und Weißwedelhirsch-SARS-CoV-2-Viren zu vergleichen, wurden die nicht identifizierten menschlichen Proben, die positiv auf SARS-CoV-2 getestet wurden, aus einer Kohorte routinemäßig an der Universität gesammelter Proben ausgewählt of Missouri Health Care, das Columbia, Missouri und die angrenzenden Landkreise abdeckt, und diese Studie wurde vom University of Missouri Institutional Review Board (Nr. 2025449) genehmigt. Geschlecht und Geschlecht wurden in dieser Studie nicht ausgeschlossen. Es wurden keine gezielten Rekrutierungsbemühungen unternommen.

Vom 4. November 2021 bis zum 4. April 2022 wurden insgesamt 8.830 Nasenabstrichproben von Weißwedelhirschen in Washington, D.C. und 26 teilnehmenden Bundesstaaten in den USA entweder durch Jäger oder Agenturen gesammelt. Keines der untersuchten Tiere zeigte klinische Anzeichen einer SARS-CoV-2-Infektion. Über 95 % der Weißwedelhirsche-Population leben im Nordosten, Mittleren Westen und Südosten der Vereinigten Staaten, vertreten durch Washington, D.C. und 26 teilnehmende Staaten in den USA, aus denen die Proben entnommen wurden46. In diesen Regionen werden auch viele der 6 Millionen Weißwedelhirsche jährlich von Jägern erlegt47. In den allermeisten Fällen wurde eine gepaarte Blutprobe zur serologischen Analyse auf einem Nobuto-Filterstreifen gesammelt.

SARS-CoV-2-RNA wurde aus oralen und nasalen Abstrichproben, die in PrimeStore Molecular Transport Media (MTM, Longhorn Vaccines and Diagnostics LLC, Katalog-Nr. LH105) konserviert wurden, unter Verwendung von MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kits (Applied Biosystems, Katalog-Nr. A32702) hergestellt gemäß den Anweisungen des Herstellers. 5 µL RNA-Extrakt dienten dem qRT-PCR-Nachweis von SARS-CoV-2 N1- und N2-Targets unter Verwendung des BioRad Reliance One-Step Supermix Kit (Katalog-Nr. 12010221) mit SARS-CoV-2 RUO Primers & Probes von Integrated DNA Technologies (Katalognummer 10006713). Die Reaktions- und Thermocyclingbedingungen waren identisch mit denen, die für den BioRad Reliance SARS-CoV-2 RT-PCR-Assay beschrieben wurden, und die Daten wurden mit dem BioRad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System oder dem CFX Opus Real-Time PCR System erfasst.

Für die RT-PCR-Amplifikation des gesamten SARS-CoV-2-Genoms wurden cDNA-Bibliotheken mit dem Nextera XT DNA Sample Prepared Kit (Katalognummer FC-131-1096) vorbereitet und die Sequenzierung wurde mit dem 500-Zyklen-MiSeq-Reagenzienkit v2 (Katalognummer MS-102-2003) gemäß den Herstelleranweisungen48. Die Qualität der aus der MiSeq-Sequenzierung erhaltenen Paired-End-Reads wurde analysiert und mit einem Phred-Qualitätswert von 20 getrimmt, was eine Base-Call-Genauigkeit von 99 % anzeigt, d. h. die Wahrscheinlichkeit, unter 100 Basen einen falschen Base-Call zu finden49. Die Sequenzassemblierung und die Konsenssequenzkonstruktion wurden mit Wuhan-Hu-1 (Zugangsnummer: NC_045512.2) als Referenzgenom unter Verwendung des Iterative Refinement Meta-Assembler (IRMA, v1.0.2)50 durchgeführt. Für die Genompositionen mit geringer Abdeckung wurden manuelle Kuratierungen und Validierungen durchgeführt. IRMA wurde verwendet, um einzelne Nukleotidvarianten (SNVs) zu analysieren und die virale Genomdiversität innerhalb des Wirts zu bewerten. Ein Minderheits-iSNV wurde identifiziert, wenn die Häufigkeit eines Allels bei den Reads mindestens 5 %, aber weniger als 50 % betrug. Darüber hinaus wurden die Konsensussequenzen mithilfe von Qiagen CLC Genomics Workbench 20.0.4 mit einem Qualitätsfaktor von 0,05 validiert.

NextStrain51 wurde verwendet, um die genomischen Sequenzen von SARS-CoV-2 abzugleichen und auch die Nukleotid- und Aminosäuresubstitutionen zwischen den SARS-CoV-2-Sequenzen des Weißwedelhirsches und der zugehörigen SARS-CoV-2-Vorläufersequenz des Menschen zu identifizieren. Aufgrund der geringen Abdeckung in der 5'-untranslatierten Region (vor Position 266) und 3'-untranslatierten Region (nach Position 29.674) des Genoms haben wir diese Positionen von Nukleotid- und Aminosäuresubstitutionsanalysen ausgeschlossen.

Die Software Phylogenetic Assignment of Named Global Outbreak Lineages (PANGOLIN) (v4.0.5)20 wurde verwendet (PANGO v4.0.6 (22.04.2022)), um Pango-Abstammungslinien für jede Weißwedelhirschsequenz zu bestimmen. Für 355 Sequenzen wurde eine genetische Abstammungsklassifizierung erreicht. Unter diesen Proben wurden nur solche mit einer hohen Sequenzierungsabdeckung über > 95 % des Referenzgenoms (n = 282), einem IRMA-Score von 95 %, für weitere Evolutionsanalysen ausgewählt.

Zeitskalierte Bayes'sche Analysen wurden unter Verwendung der Markov-Ketten-Monte-Carlo-Methode (MCMC) mit der Software Bayesian phylogenetic Analysis by Sampling Trees (BEAST)52 v.1.10.4 durchgeführt. Jeder Baum wurde durch ein HKY-Substitutionsmodell mit Gamma = 4 und einem koaleszierenden exponentiellen Wachstum mit strenger Uhr generiert. Die Länge der MCMC-Kette wurde auf 30 bis 100 Millionen Iterationen festgelegt, wobei alle 10.000 Iterationen eine Unterabtastung vorgenommen wurde. Für die Batch-BEAST-Verarbeitung wurde das babette53 R-Paket v.2.3.2 verwendet. Zur Auswertung der Ergebnisse wurde Tracer v1.7.2 verwendet. Der Maximum Clade Credibility (MCC)-Baum wurde mit TreeAnnotator54 v.1.10.4 zusammengefasst, mit einer Burn-in-Rate von 20 % und der geschätzten Zeit der Divergenz, die durch die mittlere Knotenhöhe dargestellt wird. Für die Baumvisualisierung wurde das ggtree55 R-Paket v3.8.0 verwendet.

Um festzustellen, ob SARS-CoV-2 unter Weißwedelhirschenpopulationen innerhalb desselben geografischen Gebiets oder über verschiedene geografische Gebiete hinweg übertragen wurde, führten wir bayesianische phylogeografische Analysen unter Verwendung von BEAST52 (v.1.10.4) durch. Die Bayesian Stochastic Search Variable Selection (BSSVS)-Analyse wurde mit Landkreisen als diskreten Merkmalen für die SARS-CoV-2-Sequenzen von Weißwedelhirschen durchgeführt. Übertragungsereignisse wurden nach statistischer Signifikanz anhand der Kriterien Bayes-Faktor56 und A-posteriori-Wahrscheinlichkeit >0,7 sowie geografisch nahegelegener Landkreise gefiltert. Verschiedene statistische Unterstützungsniveaus wurden wie folgt definiert: 3 \(\le\) Bayes-Faktor \(\le\) 10 zeigt Unterstützung an; 10 \(\le\) Bayes-Faktor \(\le\) 100 zeigt starke Unterstützung an; 100 \(\le\) Bayes-Faktor \(\le\) 1000 zeigt eine sehr starke Unterstützung an; und der Bayes-Faktor \(\ge\) 1000 weist auf eine entscheidende Unterstützung hin.

Um potenzielle Vorläuferviren für das SARS-CoV-2-Virus des Weißwedelhirsches zu identifizieren, haben wir alle SARS-CoV-2-Genome von Menschen und Weißwedelhirschen nach Bundesstaat und Pango-Abstammungslinie gruppiert. Als Ergebnis wurden 89 Datensätze erhalten, die jeweils SARS-CoV-2-Sequenzen von Menschen und Weißwedelhirschen aus demselben Bundesstaat und derselben Pango-Abstammungslinie enthielten. Um die Robustheit unserer Auswahl sicherzustellen, wurden zwei Methoden verwendet, um die nächstgelegenen Sequenzen für jede SARS-CoV-2-Sequenz von Weißwedelhirschen auszuwählen: 1) FastTree57 v1.4.4 wurde verwendet, um diese Sequenzen basierend auf der Topologie zu identifizieren; 2) Die Complete Composition Vector (CCV) v1.0-Methode58 wurde verwendet, um diese Sequenzen auf Basis genetischer Abstände zu identifizieren, und CCV ist eine Alignment-freie Methode, um die Messung genetischer Abstände in großem Maßstab zu ermöglichen. Die eindeutigen Sequenzen aus den 20 am besten bewerteten Sequenzen jeder Methode wurden identifiziert (Supplementary Data 10) und für bayesianische phylogenetische Analysen verwendet. Für die Sequenzdatenverarbeitung wurde das Biopython v1.79-Paket59 verwendet. Die folgenden Kriterien wurden verwendet, um zu bestimmen, ob ein menschliches SARS-CoV-2-Genom ein Vorläufervirus für ein getestetes SARS-CoV-Genom von Weißwedelhirschen war: 1) Die Genome müssen mit einer A-posteriori-Wahrscheinlichkeit von ≥ 0,70 zum selben genetischen Cluster gehören; 2) Die Nukleotididentität muss mindestens 99,85 % betragen. Um sicherzustellen, dass unsere Analysen SARS-CoV-2-Viren nicht ausschließen, die von den Viren stammen könnten, die in Weißwedelhirschen (z. B. in früheren Studien berichtet) und anderen Tieren zirkulieren, haben wir ähnliche Analysen durchgeführt, einschließlich Viren von nichtmenschlichen Wirten. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die SARS-CoV-2-Sequenzen des Weißwedelhirsches aus dieser Studie genetisch von den zuvor berichteten unterscheiden (Abb. 10). Insgesamt haben wir für 264 der 282 analysierten SARS-CoV-2-Sequenzen von Weißwedelhirschen ein menschliches Vorläufervirus identifiziert, während für die verbleibenden 18 Sequenzen kein menschliches Vorläufervirus aus demselben Bundesstaat identifiziert wurde.

Am 5. Dezember 2022 wurden insgesamt 332 SARS-CoV-2-Genome von Weißwedelhirschen von GISAID (Global Initiative on Sharing All Influenza Data) heruntergeladen. Von diesen Genomen wiesen 118 vollständige Sequenzen mit hoher Abdeckung auf (>99 % Abdeckung). und wurden zusammen mit den in dieser Studie gesammelten SARS-CoV-2-Proben von Weißwedelhirschen in die Evolutionsanalysen einbezogen. Die Zeitskala des Stammbaums wurde in Jahreseinheiten dargestellt, und der Maßstabsbalken gibt die Divergenzzeit in Jahren an.

Es ist möglich, dass eine Übertragung zwischen Weißwedelhirschen und Reisenden außerhalb des Bundesstaates erfolgt, beispielsweise durch Jagd oder Kontakt mit Tieren. Um die Einbeziehung potenzieller Übertragungsereignisse außerhalb des Bundesstaates sicherzustellen, haben wir zum 30. März 2023 die Ultrafast Sample Placement on Existing tRees (UShER) für alle 14,3 Millionen öffentlichen SARS-CoV-2-Genomdaten verwendet. UShER implementiert den Fitch-Sankoff-Algorithmus um auf die Platzierung von Mutationen in einem bestimmten Baum und in der Variantenliste und im mit Mutationen versehenen Baum zu schließen60. Für 264 Weißwedelhirsche-Sequenzen mit einer übereinstimmenden menschlichen Sequenz aus demselben Staat in unseren obigen Analysen identifizierte UShER genetisch ähnliche Virussequenzen für 230 aus demselben Staat und 30 aus menschlichen Sequenzen außerhalb des Staates. Für die 18 Weißwedelhirsche-Sequenzen ohne übereinstimmende menschliche Sequenzen aus demselben Staat in unseren vorherigen Analysen identifizierte UShER für alle genetisch nahe Sequenzviren.

Die phylogenetische Analyse von Spillover-Ereignissen wurde unter Verwendung einer Kombination aus menschlichen SARS-CoV-2-Sequenzen außerhalb des Staates, die von UShER erhalten wurden, und menschlichen Sequenzen innerhalb des Staates, die aus FastTree- und CCV-Analysen erhalten wurden, durchgeführt. Die Sequenzen wurden anhand der folgenden Kriterien ausgewählt: (1) Sie gehörten zu denselben Pango-Abstammungslinien wie die passenden Weißwedelhirsche-Sequenzen; (2) sie wurden nur in den USA gesammelt; und (3) ihr Entnahmedatum lag entweder vor dem Entnahmedatum der Weißwedelhirschproben oder stimmte mit diesem überein.

Um unabhängige potenzielle Spillover-Ereignisse von SARS-CoV-2 vom Menschen zu identifizieren und die Übertragungsdynamik von SARS-CoV-2-Viren in den Weißwedelhirschpopulationen zu verstehen, wurden drei Arten von Clustern definiert: Mensch-Hirsch, Mensch-Hirsch-Hirsch , und Mensch-Hirsch-Mensch. Für alle diese Cluster wurde mindestens ein menschliches Vorläufervirus identifiziert; diejenigen ohne menschliches Vorläufervirus wurden von dieser Analyse ausgeschlossen. Von den 282 identifizierten SARS-CoV-2-Sequenzen von Weißwedelhirschen konnten wir 238 davon einem dieser drei Cluster zuordnen (Supplementary Data 2). Für jeden Cluster werden die folgenden spezifischen Kriterien verwendet.

Mensch-Hirsch: 1) das menschliche Vorläufervirus und eine einzelne Weißwedelhirsch-SARS-CoV-2-Sequenz; 2) alle menschlichen und SARS-CoV-2-Sequenzen stammten aus demselben Staat und gehörten derselben Pango-Linie an; 3) die A-posteriori-Wahrscheinlichkeit (PP) > 0,7 für den Mensch-Hirsch-Zweig; und 4) die Nukleotidsequenzidentitäten zwischen der menschlichen Vorläufersequenz und der SARS-CoV-Sequenz des Weißwedelhirsches betrugen ≥99,85 %.

Mensch-Hirsch-Hirsch: 1) das menschliche Vorläufervirus und mindestens zwei Weißwedelhirsch-SARS-CoV-2-Sequenzen; 2) alle menschlichen und SARS-CoV-2-Sequenzen stammten aus demselben Bundesstaat und gehörten zur gleichen Pango-Abstammungslinie (eine einzelne SARS-CoV-2-Sequenz von Weißwedelhirschen aus einem anderen Bundesstaat würde aus diesem Ereignis entfernt); 3) die A-posteriori-Wahrscheinlichkeit (PP) > 0,7 für den Mensch-Hirsch-Zweig; und 4) die Nukleotidsequenzidentitäten zwischen der menschlichen Vorläufer-SARS-CoV-Sequenz und mindestens einer der Weißwedelhirsche-SARS-CoV-Sequenzen ≥99,85 %.

Mensch-Hirsch-Mensch: 1) das menschliche Vorläufervirus, mindestens zwei Weißwedelhirsch-SARS-CoV-Sequenzen und eine weitere menschliche SARS-CoV-2-Sequenz; 2) alle menschlichen und SARS-CoV-2-Sequenzen stammten aus demselben Staat und gehörten derselben Pango-Linie an; 3) die Mensch-2- und mindestens eine der Weißwedelhirsch-SARS-CoV-2-Sequenzen bildeten einen Hirsch-Mensch-2-Unterzweig; 4) PP > 0,7 sowohl für den Zweig Mensch1-Hirsch als auch für den Unterzweig Hirsch-Mensch2; 4) die Nukleotidsequenzidentität zwischen Mensch1 und mindestens einem der Weißwedelhirsche SARS-CoV-2 und die zwischen Mensch2 und mindestens einem der Weißwedelhirsche SARS-CoV-2 betrug ≥99,85 %.

Eine positive Selektion erfolgt, wenn die Rate der nicht-synonymen Substitutionen (β) größer ist als die Rate der synonymen Substitutionen (α), während eine negative Selektion auftritt, wenn β < α. Sowohl positive als auch negative Selektionsanalysen wurden mit FUBAR (Fast, Unconstrained Bayesian AppRoximation) aus der HyPhy-Software v2.5.42(MP)61, 62 durchgeführt. Die von FastTree generierten phylogenetischen Bäume jedes Gens wurden in den Analysen mit verwendet Weißwedelhirschsequenzen, die markiert sind, um die positive oder negative Selektion in einem bestimmten Zweig des Stammbaums zu testen. Wir betrachteten Standorte mit einer A-posteriori-Wahrscheinlichkeit > 0,9 als signifikant, was entweder auf eine positive Auswahl (wahrscheinlich(α < β)) oder eine negative Auswahl (wahrscheinlich(α > β)) hinweist61.

Um zu verstehen, ob Aminosäureaustausche unabhängig voneinander auftreten können, nachdem das Virus in die Population der Weißwedelhirsche eingeschleppt wurde, haben wir versucht, diese wiederholten Aminosäureaustausche in den Clustern Mensch-Hirsch, Mensch-Hirsch-Hirsch und Mensch-Hirsch zu identifizieren. Menschlich. Eine wiederholte Aminosäuresubstitution wurde anhand der folgenden Kriterien definiert: 1) Die Substitution wurde mindestens zweimal in den 106 innerstaatlichen Clustern Mensch-Hirsch, Mensch-Hirsch-Hirsch und Mensch-Hirsch-Mensch beobachtet; 2) Die Substitution wurde nicht bei allen menschlichen SARS-CoV-2-Viren derselben Abstammungslinie aus demselben Staat nachgewiesen; 3) Die Substitution hatte eine geringe Häufigkeit (z. B. <0,15 %, ermittelt durch Outbreak.info R-Paket v0.2.063) in allen menschlichen SARS-CoV-2-Viren aus den USA und weltweit. Wenn eine wiederholte Aminosäuresubstitution unter positiver Selektion stand, wurde sie als eine an Weißwedelhirsche angepasste Substitution definiert.

Um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit unserer Analysen zu verbessern und potenzielle Probleme zu mildern, die sich aus bestimmten Genompositionen ergeben, die anfällig für Sequenzierungsfehler und Rekombinationen sind, haben wir einen Maskierungsansatz zur Verfeinerung unserer Analysen untersucht. Konkret haben wir wie berichtet 265 problematische Positionen maskiert (Quelle: https://github.com/WL/ProblematicSites_SARS-CoV2), gefolgt von phylogenetischen Analysen. Die resultierenden Baumtopologien, die aus dem vollständigen Genombaum (siehe Beschreibung oben) und dem Baum mit den maskierten Positionen abgeleitet wurden, zeigten eine bemerkenswerte Ähnlichkeit (Supplementary Data 12). Durch den Ausschluss der gemeldeten Positionen aus dem Baum führten wir eine erneute Analyse der Übertragungsereignisse durch und die Anzahl der Übertragungsereignisse blieb bei Verwendung derselben Identifikationsregeln unverändert. Wir führten auch eine Bewertung durch und stellten fest, dass innerhalb der 265 problematischen Positionen keine der für Weißwedelhirsche spezifischen adaptiven Substitutionen gefunden wurde. Daher scheint es, dass die maskierten Positionen keinen wesentlichen Einfluss auf die in dieser Studie durchgeführten Analysen haben. Daher wurden alle in dieser Studie durchgeführten Analysen ohne Anlegen einer Maske an den genannten 265 Positionen durchgeführt.

Die aus öffentlichen Datenbanken erhaltenen genomischen Sequenzen der meisten Weißwedelhirsch-SARS-CoV-2-Viren und ihrer entsprechenden potenziellen menschlichen SARS-CoV-2-Vorläuferviren zeigten eine hohe genomische Nukleotidsequenzidentität von über 99,80 % (ergänzende Abbildung 2a). ). Um die Zuverlässigkeit der zur Definition von Übertragungsereignissen verwendeten Parameter, nämlich Sequenzidentität und Posterior-Wahrscheinlichkeit, zu beurteilen, führten wir zusätzliche Analysen durch, die verschiedene Parameterbereiche umfassten. Unsere in der ergänzenden Abbildung 2b – e dargestellten Ergebnisse zeigten, dass die Anzahl der Spillover-Ereignisse bei Verwendung eines Sequenzidentitäts-Cutoffs von 99, 85 % oder weniger recht konstant blieb. Beispielsweise haben wir insgesamt 110 Spillover-Ereignisse mit einer Sequenzidentität von 99,80 % oder weniger entdeckt. Als jedoch der Sequenzidentitäts-Cutoff strenger wurde, nahm die Anzahl der Cluster aufgrund des Fehlens entsprechender menschlicher SARS-CoV-2-Vorläuferviren deutlich ab. Konkret identifizierten wir 100 Spillover-Ereignisse mit einer Sequenzidentität von 99,90 % und nur 66 Ereignisse mit einer Sequenzidentität von 99,95 %. Umgekehrt hatte die A-Posteriori-Wahrscheinlichkeit keinen nennenswerten Einfluss auf die Anzahl der Übertragungsereignisse, da die mit der Mehrzahl dieser Ereignisse verbundenen Baumunterklassen eine A-Posteriori-Wahrscheinlichkeit von 0,90 oder höher aufwiesen. Nur die Unterklasse, die mit einem Mensch-Hirsch-Mensch-Spillover-Ereignis verbunden war, hatte eine A-posteriori-Wahrscheinlichkeit von 0,78 und eine andere mit einem Mensch-Hirsch-Spillover-Ereignis hatte eine A-posteriori-Wahrscheinlichkeit von 0,66. Diese Parameterabstimmungsanalysen bestätigen weiterhin die Robustheit der bei der Analyse von Übertragungsereignissen verwendeten Kriterien. Insbesondere wurden ein Sequenzidentitäts-Cutoff von 99,85 % und eine A-Posteriori-Wahrscheinlichkeit von 0,70 als zuverlässige und wirksame Schwellenwerte validiert.

Antikörper wurden aus Nobuto-Filterpapierstreifen (Sterlitech, Katalognr. 49010010) extrahiert und im National Wildlife Research Center des US-Landwirtschaftsministeriums (Fort Collins, USA) in einer funktionellen Verdünnung von 1:20 untersucht. Extrahierte Proben wurden mithilfe eines Ersatz-Virusneutralisationstests (sVNT, Genscript cPass™, Katalognummer L00847-A) gescreent, wobei die Daten mit einem VarioSkan Flash- oder Varioskan LUX-Multimode-Mikroplattenlesegerät (Thermo Fisher)16 erfasst wurden. Für die Berechnung der durchschnittlichen prozentualen Hemmung wurden mindestens zwei technische Replikate verwendet. Der sVNT wurde nicht für Hirsche validiert; Frühere Auswertungen mit Serumproben von Weißwedelhirschen deuteten jedoch darauf hin, dass die sVNT-Ergebnisse qualitativ einem hochspezifischen SARS-CoV-2-Virus-Neutralisationstest ähnelten16.

Strukturvorlagen verschiedener Funktionen mit Genen des SARS-COV-2 wurden von der Protein Data Bank (PDB)64 heruntergeladen. Die Sequenzen von Weißwedelhirschen wurden von MUSCLE v5.165 mit den Vorlagensequenzen abgeglichen. Die Visualisierung wurde mit PyMOL v2.5.466 durchgeführt.

Alle verfügbaren SARS-CoV-2-Genomsequenzen (n = 11.778.398 bis 09.07.2022) von Menschen wurden von GISAID heruntergeladen, und zusätzliche Genome (n = 1.020.486 bis 07.04.2022) wurden von GenBank kuratiert. Aus diesen Sequenzen wurden menschliche SARS-CoV-Sequenzen aus den 23 Staaten ausgewählt, in denen wir die Sequenzen von Weißwedelhirschen entnommen haben. Nach dem Entfernen redundanter Einträge und der Auswahl der vollständigen Sequenzen und Sequenzen mit hoher Abdeckung wurden für diese Studie insgesamt 717.717 SARS-CoV-2-Genomsequenzen erhalten. Darüber hinaus haben wir am 5. Dezember 2022 insgesamt 332 SARS-CoV-2-Genome von Weißwedelhirschen von GISAID heruntergeladen. Unter diesen Genomen hatten 118 vollständige Sequenzen mit hoher Abdeckung (>99 % Abdeckung) und wurden zusammen mit den in dieser Studie gesammelten SARS-CoV-2-Proben von Weißwedelhirschen in die Evolutionsanalysen einbezogen. Alle diese öffentlich verfügbaren Sequenzen und zugehörigen Metadaten, die in diesem Datensatz verwendet werden, werden in der EpiCoV-Datenbank von GISAID und den NCBI SARS-CoV-2-Ressourcen veröffentlicht.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Genomdaten aller in dieser Studie generierten SARS-CoV-2-Viren wurden an GISAID und NCBI GenBank übermittelt. Ergänzende Daten 1 enthalten die GISAID- und Bioproject-Zugangsnummern sowie zugehörige Metadaten für diese Sequenzen. Im Fall menschlicher SARS-CoV-2-Sequenzen finden Sie die zugehörigen Stammnamen und GISAID-Zugangsnummern in den Zusatzdaten 8. Um auf die GISAID-Datenbank zuzugreifen, müssen sich Benutzer gemäß den Anweisungen der GISAID-Datenbank anmelden. Sobald Benutzer angemeldet sind, können Benutzer in der GISAID-Datenbank Sequenz- und Metadatendaten suchen und abrufen, indem sie entweder eine bestimmte Zugangsnummer oder einen bestimmten Stammnamen verwenden. Darüber hinaus können andere öffentliche Daten, die in dieser Studie verwendet werden, von GISAID und GenBank, NCBI, abgerufen werden. Darüber hinaus kann in der Quelldatendatei auf die Originaldaten zugegriffen werden, die zur Erstellung von Balkendiagrammen und Geodatenvisualisierungen verwendet werden. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Die Quellcodes für die Skripte, die für molekulare Analysen verwendet werden, sind unter https://github.com/FluSysBio/WTD_SARS-CoV-2_Transmission verfügbar und können auch unter https://doi.org/10.5281/zenodo.801075867 abgerufen werden.

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Referenzen herunterladen

Dieses Projekt wird durch die Bestimmung des American Rescue Plan Act finanziert, um die Überwachung und Überwachung anfälliger Tiere für SARS-CoV-2 durchzuführen (Fördernummer: AP22WSNWRC00C019 an XFW). CYT wurde durch ein Ausbildungsstipendium des National Institute of Allergy and Infectious Diseases der National Institutes of Health unter der Fördernummer F30AI172230 unterstützt. Wir danken den Bundesmitarbeitern von USDA APHIS Wildlife Services und den Mitarbeitern staatlicher Wildtierbehörden für ihre Expertise bei der Wildtierprobenahme sowie den Jägern für ihre Teilnahme an dieser groß angelegten Aktion. Wir möchten außerdem Robert Pleszewski, Christopher Quintanal, Joshua Eckery und Jason Klemm vom USDA APHIS National Wildlife Research Center für die Laboruntersuchung von Abstrich- und Nobuto-Proben danken. Wir danken Rich Chipman, Dennis Kohler, Derek Collins, Kelsey Weir, Tim Linder, Jourdan Ringenberg und Jon Heale für ihre Unterstützung bei der Projektentwicklung und -umsetzung sowie Kim Pepin, Joshua Hewitt und Cheng Gao für ihre kritische Diskussion. Darüber hinaus möchten wir Dr. Jun Hang und Tao Li für die Sequenzierung menschlicher SARS-CoV-2-Viren danken, die in dieser Studie verwendet wurden, und Kritika Prasai für die Erstellung der BAM-Dateien, die für Polymorphismusanalysen verwendet werden. Die Erkenntnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht stammen von den Autoren und geben nicht unbedingt die offizielle Position der US-Regierung wieder.

Zentrum für Influenza und neu auftretende Infektionskrankheiten, University of Missouri, Columbia, MO, USA

Aijing Feng, Cynthia Y. Tang und Xiu-Feng Wan

Abteilung für Molekulare Mikrobiologie und Immunologie, School of Medicine, University of Missouri, Columbia, MO, USA

Aijing Feng & Xiu-Feng Wan

Bond Life Sciences Center, University of Missouri, Columbia, MO, USA

Aijing Feng, Cynthia Y. Tang und Xiu-Feng Wan

USDA APHIS Wildlife Services National Wildlife Disease Program, Fort Collins, CO, USA

Sarah Bevins und Julianna Lenoch

National Wildlife Research Center, Wildlife Services, Inspektionsdienst für Tier- und Pflanzengesundheit, US-Landwirtschaftsministerium, Fort Collins, CO, USA

Jeff Chandler und Susan Shriner

USDA APHIS Wildlife Services, Fort Collins, CO, USA

Thomas J. DeLiberto

One Health Office, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA

Ria Ghai

National Veterinary Services Laboratories, Inspektionsdienst für Tier- und Pflanzengesundheit, Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten, Ames, IA, USA

Kristina Lantz & Mia Torchetti

Nationales Zentrum für Immunisierung und Atemwegserkrankungen, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA

Adam Retchless, Suxiang Sue Tong und Anna Uehara

MU-Institut für Datenwissenschaft und Informatik, University of Missouri, Columbia, MO, USA

Cynthia Y. Tang & Xiu-Feng Wan

Fakultät für Elektrotechnik und Informatik, College of Engineering, University of Missouri, Columbia, MO, USA

Xiu-Feng Wan

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Konzeptualisierung: TJD, SS, JC, MT und XFW Methodik: AF, JC, AR, KL, MT, XFW Untersuchung: AF, SB, JC, TJD, RG, KL, JL, AR, SS, CYT, SST, MT , AU, XFW Visualisierung: AF, TJD, XFW Finanzierungseinwerbung: TJD, JL, XFW Projektverwaltung: TJD und Überprüfung und Bearbeitung: AF, SB, JC, TJD, RG, AR, SS, CYT, SST, XFW

Korrespondenz mit Thomas J. DeLiberto oder Xiu-Feng Wan.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Feng, A., Bevins, S., Chandler, J. et al. Übertragung von SARS-CoV-2 bei freilaufenden Weißwedelhirschen in den Vereinigten Staaten. Nat Commun 14, 4078 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39782-x

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Eingegangen: 07. Februar 2023

Angenommen: 29. Juni 2023

Veröffentlicht: 10. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39782-x

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