Monozyten | Liaoning Cryovials Inc.

Nature Microbiology Band 8, Seiten 833–844 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Entwicklung persistenter zellulärer Reservoire des latenten humanen Immundefizienzvirus (HIV) stellt ein entscheidendes Hindernis für die Virusausrottung dar, da ein viraler Rebound stattfindet, sobald die antiretrovirale Therapie (ART) unterbrochen wird. Frühere Studien zeigen, dass HIV in myeloischen Zellen (Monozyten und Makrophagen) im Blut und Gewebe virologisch unterdrückter Menschen mit HIV (vsPWH) persistiert. Allerdings bleibt unklar, wie myeloische Zellen zur Größe des HIV-Reservoirs beitragen und welchen Einfluss sie auf den Rebound nach einer Behandlungsunterbrechung haben. Hier berichten wir über die Entwicklung eines quantitativen viralen Wachstumstests (MDM-QVOA) für aus menschlichen Monozyten gewonnene Makrophagen und hochempfindlicher T-Zell-Nachweistests zur Bestätigung der Reinheit. Wir bewerten die Häufigkeit von latentem HIV in Monozyten mithilfe dieses Assays in einer longitudinalen Kohorte von vsPWH (n = 10, 100 % männlich, ART-Dauer 5–14 Jahre) und stellen fest, dass die Hälfte der Teilnehmer latentes HIV in Monozyten aufwies. Bei einigen Teilnehmern konnten diese Reservoirs über mehrere Jahre hinweg nachgewiesen werden. Darüber hinaus untersuchten wir HIV-Genome in Monozyten von 30 vsPWH (27 % männlich, ART-Dauer 5–22 Jahre) mithilfe eines myeloidadaptierten intakten proviralen DNA-Assays (IPDA) und zeigten, dass bei 40 % der Teilnehmer und mehr intakte Genome vorhanden waren Gesamt-HIV-DNA korrelierte mit reaktivierbaren latenten Reservoirs. Das im MDM-QVOA produzierte Virus war in der Lage, umstehende Zellen zu infizieren, was zu einer Virusausbreitung führte. Diese Ergebnisse liefern einen weiteren Beweis dafür, dass myeloische Zellen der Definition eines klinisch relevanten HIV-Reservoirs entsprechen, und unterstreichen, dass myeloische Reservoire in die Bemühungen um eine HIV-Heilung einbezogen werden sollten.

Mehrere Hinweise zeigen, dass das Humane Immundefizienzvirus (HIV) in Blutmonozyten und Gewebemakrophagen bei virologisch unterdrückten Menschen mit HIV (vsPWH)1 persistiert. HIV-DNA wurde in hochgereinigten Monozyten1,2,3,4,5 und aus der Harnröhre6, dem Darm7, der Leber8 und dem Gehirn9,10 von vsPWH isolierten Makrophagen nachgewiesen. Darüber hinaus können Viren aus Makrophagenreservoirs nach einer Behandlungsunterbrechung zurückprallen und das Reservoir erneut besiedeln. Daten aus der „Last Gift“-Kohorte zeigen, dass infizierte Gehirne während des Rebounds die Virusreservoirs neu besiedeln können11. Über die Größe des myeloiden (Monozyten/Makrophagen)-Reservoirs ist jedoch wenig bekannt. Eine myeloidspezifische Einschränkung der HIV-Latenzumkehr und der Gewebelokalisierung kann die Ausrottung des Myeloidreservoirs erschweren. Es gibt nur begrenzte Studien, die untersuchen, ob HIV in Monozyten reaktiviert werden kann, um infektiöse Viren bei vsPWH zu produzieren. Die wenigen Studien, die versucht haben, reaktivierbare Reservoire in Monozyten12,13 zu bewerten, verwendeten häufig Tests, die nicht für die einzigartige Biologie dieser Zellen optimiert waren, was zu gemischten Ergebnissen führte. Derzeit gibt es keine standardisierten, reproduzierbaren Methoden zur Beurteilung der HIV-Reaktivierung aus dem Monozytenreservoir, und wir müssen noch die Rolle von Monozyten bei der Aufrechterhaltung von Gewebemakrophagenreservoirs klären. Monozyten, die replikationskompetente Viren enthalten, können Gewebemakrophagenreservoirs neu aussäen, wenn sie das Blut verlassen, und sich in von Monozyten abgeleitete Makrophagen (MDM) differenzieren. Daher haben wir einen quantitativen MDM-Virusauswuchstest (MDM-QVOA) für HIV entwickelt. Wir haben die replikationskompetenten und DNA-MDM-Reservoirs in einer longitudinalen Kohorte von vsPWH quantifiziert und sie direkt mit CD4-T-Zellreservoirs bei denselben Personen verglichen.

Fünfzehn Menschen mit HIV (PWH; 4 virämische (v) und 11 langfristig virussupprimierte (vs) PWH, alle männlich) bildeten die QVOA-Kohorte. Die Kohorte des intakten proviralen DNA-Assays (IPDA) bestand aus 30 vsPWH (27 % männlich). Die in beiden Kohorten verwendeten vsPWH erhielten zwischen 5 und 22 Jahren eine langfristige supprimierende ART und es wurden während des Untersuchungszeitraums keine viralen Ausbrüche gemeldet. Die Teilnehmer sind in der erweiterten Datentabelle 1 beschrieben.

Das menschliche MDM-QVOA wurde auf der Grundlage unserer früheren Studien zu mit dem Simian Immunodeficiency Virus (SIV) infizierten ART-supprimierten Makaken entwickelt14,15. Ein Kritikpunkt an der Verwendung des SIV-Modells zur Untersuchung myeloider Zellreservoirs ist, dass Makaken im Vergleich zu vsPWH nicht über einen längeren Zeitraum mit ART behandelt werden. Aus diesem Grund haben wir ein menschliches MDM-QVOA unter Verwendung von Blut von vsPWH entwickelt. Mithilfe eines virämischen Teilnehmers (CP55, Abb. 1a) bestimmten wir die geeignete Expanderzelllinie für den Test. Allein die Medien unterstützten das virale Wachstum, allerdings in geringerem Maße. Die Hinzufügung einer Expander-Zelllinie optimierte die Virusvermehrung und den Nachweis im Assay. Monozyten wurden unter homöostatischen (M0) Bedingungen16 aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) des Spenders differenziert und unter Verwendung von Phorbol 12-Myristat-13-Acetat (PMA) in Gegenwart von MT-4, CEMx17414,15 und Molt-4-CCR517 aktiviert. Alle Zelllinien hatten vergleichbare Ausgangswerte von CCR5, CXCR4 und CD4 (Erweiterte Daten, Abb. 1). MT-4s förderten die Freisetzung von Viren aus MDMs und unterstützten eine produktive Infektion für die Dauer des Tests. Molt-4-CCR5-Zellen begannen nach 10 Tagen in Kultur abzusterben und CEMx174 vermehrte das Virus nicht effizient. Daher wurden MT-4-Zellen als Expanderzelllinie für zukünftige MDM-QVOAs verwendet.

a: Um die geeignete Expanderzelllinie zu bestimmen, wurde ein virämisches vPWH mit PMA im Kontext von MT-4, Molt-4-CCR5, CEMx174 und nur Medien aktiviert. Die gepunktete Linie zeigt die Nachweisgrenze (LOD) an. b: Um die beste Aktivierungsbedingung zu ermitteln, wurden 7 Teilnehmer (n = 7, 4 vPWH und 3 viral unterdrückte vsPWH) mit PMA, IL-4, TNF𝛼 und Medien mit und ohne MT-4-Expanderzellen aktiviert; Mittelwert ± sd c, Um festzustellen, ob Makrophagen, die aus negativ ausgewählten Monozyten stammen, ähnlich wie Makrophagen, die aus ganzen PBMCs stammen, reaktiviert werden können, verglichen wir 3 Teilnehmer (n = 3, 1 vPWH und 2 vsPWH), die mit PMA aktiviert und mit MT kokultiviert wurden. 4. d–f, Um den geeigneten Assay zum Nachweis einer T-Zell-Kontamination in der Vertiefung oder durch Phagozytose zu bestimmen, haben wir die CD3ε- und TCRβ-RNA-Expression in CD4-T-Zellen untersucht, die aus gesunden Spendern (HD) isoliert wurden. d, Die CD4-T-Zellen von 3 HD wurden seriell verdünnt, lysiert und RNA extrahiert, um die TCRβ- und CDε-Expression zu messen; Mittelwert ± SD TCRβ (e) und CDε (f) zeigten eine ähnliche Variabilität über alle Replikate hinweg, außer am unteren Ende des Tests. g, CD4 T-Zellen wurden aus 8 HD isoliert; 1 × 106 CD4s pro Spender wurden lysiert und auf CD3ε- und TCRβ-Expression untersucht, um die Kopien von jedem pro Zelle zu bestimmen; Der Balken gibt den Mittelwert an. h, Gesunde MDMs wurden mit HIV+ CD4 T-Zellen von zwei Spendern (CP11 und 21) mit und ohne PMA-Aktivierung co-kultiviert, um zu bestimmen, ob HIV+ CD4 T-Zellen virale Nukleinsäuren auf MDM übertragen konnten; n = 2. i, Ein Schema des endgültigen MDM-QVOA-Versuchsdesigns.

Quelldaten

Um die MDM-Zellaktivierung zu maximieren, haben wir drei Aktivierungsmethoden getestet: PMA, TNF𝛼 und IL-4 (Abb. 1b). Unter Verwendung von MDMs, die unter M0-Bedingungen von 7 Teilnehmern (4 virämisch und 3 supprimiert) erzeugt wurden, reaktivierte PMA HIV im Vergleich zu TNF𝛼 und IL-4 sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von MT-4 zuverlässiger. Daher wurde PMA verwendet, um MDMs für nachfolgende QVOAs zu aktivieren. Die Kulturbedingungen wurden unter Verwendung von MDMs festgelegt, die sich durch Zelladhärenz von Gesamt-PBMCs unterschieden. Allerdings war die Reinigung der Monozyten mit Magnetkügelchen vorzuziehen, um die Aufnahme von CD4 während des Differenzierungsprozesses zu verhindern (Extended Data Abb. 2). MDMs aus gereinigten Monozyten und Gesamt-PBMCs derselben Spender wurden unter denselben Kulturbedingungen bewertet und waren gleichwertig (Abb. 1c).

Ein Hauptproblem bei Tests auf myeloisches HIV ist die T-Zell-Kontamination, die zum beobachteten Signal beiträgt. Aus diesem Grund haben wir im gesamten MDM-QVOA mehrere Kontrollpunkte entwickelt, um das Vorhandensein von T-Zellen zu beurteilen, wie in den Methoden unter Reinheitsprüfungen beschrieben. In der Vergangenheit haben wir TCRβ-RNA verwendet, um zu bestimmen, ob T-Zellen im Makaken-Makrophagen-QVOA14,15 vorhanden waren. Um festzustellen, ob TCRβ-RNA auch für das menschliche MDM-QVOA geeignet ist, haben wir sowohl TCRβ- als auch CD3ε8-RNA in gereinigten T-Zellen untersucht und deren Expressionsniveaus quantifiziert. Wir stellten fest, dass TCRβ-RNA-Messungen am unteren Ende des Assays empfindlicher und reproduzierbarer waren als bei CD3ε (Abb. 1d – f). Darüber hinaus haben wir durch die Bestimmung der Zellzahl (unter Verwendung eines Einzelkopie-Gens, IFNβ) in gereinigten CD4-T-Zellen gleichzeitig mit CD3ε- und TCRβ-RNA festgestellt, dass wir im Mittel 150 Kopien von CD3ε und 174 Kopien von TCRβ pro CD4 (CD3ε) wiedergewinnen konnten Bereich 100–590 Kopien und TCRβ Bereich 90–380 Kopien, Abb. 1g). Da der CD3ε-Assay den CD4-Nachweis nicht wesentlich verbesserte, verwendeten wir daher den TCRβ-RNA-Assay zum Nachweis von T-Zellen in nachfolgenden QVOAs. Frühere Studien legen nahe, dass Makrophagen durch Phagozytose von HIV-infizierten CD4-T-Zellen infiziert werden18,19,20. Um das Potenzial der CD4-Phagozytose als Signalquelle im MDM-QVOA auszuschließen, haben wir ein Kontrollexperiment entwickelt, um zu beurteilen, ob HIV+ CD4-T-Zellen unter unseren QVOA-Bedingungen virale Nukleinsäuren auf gesundes MDM übertragen können. Wir beobachteten keinen Transfer viraler Nukleinsäuren (RNA oder DNA) auf MDM, als wir HIV+ CD4 T-Zellen von zwei ART-supprimierten Spendern (CP11 und CP21) für 12 Tage mit und ohne PMA-Aktivierung gemeinsam kultivierten (Abb. 1h). Dies liefert einen weiteren Beweis dafür, dass eine geringfügige CD4-Kontamination im MDM-QVOA nicht für das im Assay beobachtete Signal verantwortlich ist. Die Auswertung dieser Experimente führte zur Entwicklung des MDM-QVOA-Assays, der in den Methoden und in Abb. 1i beschrieben ist.

Um das Monozytenreservoir in einer kleinen Kohorte von vsPWH (n = 10, alle männlich) zu beurteilen, haben wir Blutproben entnommen und HIV-DNA (gag) und RNA (gag und tat/rev) in MDMs und CD4s aus derselben Blutabnahme gemessen ( Abb. 2a). Wir haben isolierte CD4s von 10 Teilnehmern bewertet; alle hatten nicht nachweisbare bis niedrige Mengen an tat/rev (3/10 positiv, mittlere 3,1 Kopien pro Million Zellen), niedrige Mengen an gag-RNA (7/10 positiv, mittlere 4,3 Kopien pro Million Zellen) und hohe Mengen an gag-DNA (8). /10 positiv, Median 1.514 Kopien pro Million Zellen). MDMs von denselben 10 Teilnehmern wurden ebenfalls bewertet, und 6 von 10 Teilnehmern wurden zwei- bis viermal wiederholt, was insgesamt 16 bis 20 Datenpunkte ergab. MDMs hatten nicht nachweisbare bis geringe Mengen an tat/rev (2/16 positiv, im Mittel 2 Kopien pro Million Zellen) und gag-RNA (5/16 positiv, im Mittel 2,5 Kopien pro Million Zellen) und geringe Mengen an gag-DNA (20/20 positiv). , Median 135,7 Kopien pro Million Zellen). Um die Variabilität der HIV-Gag-DNA in MDMs im Laufe der Zeit zu testen, haben wir den Gag in MDM untersucht, der von 6 Teilnehmern bei mehreren Blutentnahmen im Abstand von etwa 150–1.300 Tagen erzeugt wurde. Alle DNA-Messungen lagen innerhalb eines Logs (Abb. 2b), was darauf hindeutet, dass die HIV-DNA-Spiegel in den MDMs dieser Teilnehmer stabil sind. Im Durchschnitt hatten MDMs im Vergleich zu ihren CD4-Gegenstücken eine zehnfach geringere HIV-DNA (P < 0,0001, Abb. 2a). Alle MDM-Proben wurden auch durch Messung der TCRβ-RNA auf T-Zell-Kontamination untersucht (Abb. 2c). Wir beobachten eine geringe bis gar keine T-Zell-Kontamination, da nur ein Teilnehmer (CP56-Besuch 1) 100 CD4+ T-Zellen pro Million Zellen aufwies. Dieser Teilnehmer hatte eine Messung von 1.885 HIV-Gag-Kopien pro Million CD4s; Somit würde eine Kontamination von 100 Zellen wahrscheinlich 0,189 Gag-Kopien beitragen. In der MDM-Zellfraktion hatte dieser Teilnehmer 128 Kopien von gag pro Million MDM, daher wurden 0,15 % des Signals von CD4-T-Zellen beigetragen. Zusätzlich untersuchten wir bei 4 Teilnehmern die HIV-Gag-DNA in Monozyten vor und nach der MDM-Differenzierung (Abb. 2d). Alle (4/4) Personen hatten HIV-Gag-DNA sowohl in Monozyten als auch in MDM in ähnlichen Mengen. Daher können wir mit Sicherheit sagen, dass MDMs aus diesen vsPWH etwa zehnmal weniger HIV-gag-DNA enthalten als ihre entsprechenden CD4-T-Zellen und in ähnlichen Mengen wie Monozyten vor der Differenzierung.

a: Zehn vsPWH wurden auf HIV-gag-DNA, gag-RNA und tat/rev-RNA in isolierten CD4-T-Zellen (n = 10) und MDMs (n = 20) untersucht, 6 Spender wurden zwei- bis viermal wiederholt. ****P < 0,0001, zweiseitiger ungepaarter t-Test. b: HIV-Gag-DNA in MDMs wurde bei 6 Spendern bei mehreren Blutentnahmen im Abstand von 150–1.300 Tagen untersucht. c, Die Anzahl der CD4-T-Zellen pro Million in MDM-Kulturen ausplattierter Zellen, berechnet unter Verwendung der TCRβ-RNA- und CD4-Prozentsätze im Vollblut; n = 15, 3 Spender wurden 2–3 Mal wiederholt, die Linie zeigt den Median an. d: Bei einer Untergruppe von Personen wurde die HIV-Gag-DNA in Monozyten und MDM aus derselben Blutentnahme untersucht. n = 4. e, Monozyten und CD4-T-Zellen wurden aus 30 vsPWH isoliert und mittels IPDA auf HIV-provirale DNA untersucht. Die Werte des intakten, 3'-defekten, 5'-defekten und gesamten proviralen Genoms pro Million Zellen wurden zwischen den Zelltypen verglichen; intakt **P = 0,0014, 3' del *P = 0,03, 5' del ***P = 0,0005, gesamt **P = 0,006, zweiseitiger ungepaarter t-Test. f, Vergleich der intakten Genomwerte in einer Untergruppe von Teilnehmern, die sowohl in CD4 als auch in Monozyten nachweisbare intakte Genome aufwiesen; n = 12, zweiseitiger gepaarter t-Test. NS, nicht signifikant. Jeder Datenpunkt stellt Daten eines bestimmten Teilnehmers dar, Kreise sind CD4-Daten, Quadrate sind Monozyten- oder MDM-Daten und Linien stellen Mediane dar.

Quelldaten

Um weitere Beweise für das Vorhandensein eines HIV-DNA-Reservoirs in Monozyten zu liefern, haben wir IPDA21 an Monozyten und CD4-T-Zellen durchgeführt, die bei derselben Blutentnahme aus 30 vsPWH isoliert wurden (Abb. 2e). Wie erwartet hatten 100 % der Teilnehmer nachweisbares Provirus in CD4-T-Zellen (Median 614 Kopien pro Million Zellen), 83 % hatten nachweisbares intaktes Provirus (25/30 positiv, Median der nachweisbaren Werte 46,3 Kopien pro Million Zellen), 93 % hatten nachweisbares Provirus 5'-defektes Provirus (28/30 positiv, Median der nachweisbaren Werte 335 Kopien pro Million Zellen) und 97 % hatten nachweisbares 3'-defektes Provirus (29/30 positiv, Median der nachweisbaren Werte 295,3 Kopien pro Million Zellen). Darüber hinaus hatten 100 % der untersuchten Teilnehmer nachweisbares Provirus in Monozyten (Median 32,8 Kopien pro Million Zellen) in mindestens einer Form, 40 % hatten nachweisbares intaktes Provirus (12/30 positiv, Median der nachweisbaren Werte 6,6 Kopien pro Million Zellen), 90 % hatten nachweisbare 5'-defekte (27/30 positive, Median der nachweisbaren Werte 21 Kopien pro Million Zellen) und 3'-defekte (27/30 positive, Median der nachweisbaren Werte 13 Kopien pro Million Zellen) Proviren. Die Monozytendaten werden nach Anpassung an die CD4-T-Zell-Kontamination gemeldet, die zum Zeitpunkt der Isolierung mittels Durchflusszytometrie gemessen wurde (beschrieben in Tabelle 2 mit erweiterten Daten und Methoden). Insgesamt wiesen CD4-T-Zellen höhere Mengen an intakten, 3'-defekten und 5'-defekten Proviren auf als Monozyten. Beim Vergleich des intakten Reservoirs in einer Untergruppe von Teilnehmern, die in beiden Zelltypen nachweisbare intakte Genome aufwiesen (12/30), war der Unterschied zwischen den Zelltypen jedoch nicht mehr signifikant, wobei der mittlere intakte Provirus bei 6,6 Kopien pro Million Monozyten gemessen wurde 38,9 Kopien pro Million CD4-T-Zellen (P = 0,16, Abb. 2f). Diese Daten liefern einen weiteren Beweis dafür, dass Monozyten von vsPWH im Vergleich zu ihren CD4-T-Zell-Gegenstücken HIV-DNA-Genome in geringeren Mengen enthalten. Dies liefert Hinweise darauf, dass Monozyten in einer Untergruppe von vsPWH intakte HIV-Genome enthalten, die bei der Monozytendifferenzierung möglicherweise replikationskompetent sind.

Die Messung der HIV-DNA gilt nicht als genaue Beurteilung des replikationskompetenten Reservoirs. Daher haben wir reaktivierbare Reservoire mithilfe zellspezifischer QVOAs bewertet (Abb. 3a). Wir führten CD4-T-Zell- und MDM-QVOAs bei 10 vsPWH durch und stellten fest, dass 9/10 Teilnehmer reaktivierbares Provirus in CD4-T-Zellen hatten (Median 1,6 infektiöse Einheiten pro Million Zellen (IUPM)) und 5/10 reaktivierbares Provirus in MDM hatten (Median 0,44). IUPM). Fünfzig Prozent hatten induzierbare Proviren in der MDM-Zellfraktion mit einer Rate von etwa 1 zu 2,5 Millionen Zellen. Zellreinheiten, Input und Nachweisgrenzen sind in der erweiterten Datentabelle 3 aufgeführt.

a: Zehn vsPWH wurden auf reaktivierbare Reservoire in CD4-T-Zellen und MDMs untersucht, die aus derselben Blutentnahme isoliert wurden, unter Verwendung der zellspezifischen CD4- und MDM-QVOAs. b: Vier Teilnehmer kehrten 150–280 Tage nach dem ersten Besuch zu einem zweiten Besuch zurück. Bei allen Teilnehmern wurde eine wiederholte MDM-QVOA abgeschlossen und bei einem Teilnehmer wurde auch eine wiederholte CD4-QVOA abgeschlossen (CP36, orangefarbener Kreis). Zwei der vier Teilnehmer kehrten 1.174 bzw. 1.502 Tage nach ihrem ersten Besuch zu einem dritten Nachuntersuchungsbesuch zurück, um den MDM-QVOA zu wiederholen. c, Durchschnittliche HIV-gag-RNA-Kopien pro Million Zellen, die im CD4- und MDM-QVOA ausplattiert wurden; n = 9 CD4 und n = 10 MDM, nicht signifikant über ungepaarten t-Test. d: Teilnehmer mit nachweisbaren IUPM-Werten in MDM-QVOA hatten höhere Konzentrationen an HIV-gag-DNA im Vergleich zu Teilnehmern mit nicht nachweisbaren IUPM-Werten; n = 9 nachweisbar und n = 5 nicht nachweisbar, zweiseitiger ungepaarter Student-t-Test P = 0,0122. e, MDM-DNA-Spiegel korrelierten positiv mit MDM-IUPM-Werten; einfache lineare Regression R2 = 0,48 und P = 0,04. f,g, Vergleich der Prozentsätze der Immunzellen im Blut von Teilnehmern mit nachweisbaren (n = 10) und nicht nachweisbaren (n = 5) IUPM-Werten in MDM QVOA; Gesamtmonozyten (TLR2+/CD3−) und CD4-T-Zellen (f) sowie Monozyten-Untergruppen (g).

Quelldaten

Da sich MDMs von Monozyten unterscheiden – Zellen, von denen angenommen wird, dass sie eine begrenzte Lebensdauer im Blutkreislauf (Tage)22 und eine weniger bekannte Lebensdauer im Gewebe (Monate bis Jahre) – haben, ist der Nachweis eines reaktivierbaren Provirus zu einem einzigen Zeitpunkt möglicherweise kein Hinweis auf a persistentes Reservoir. Um festzustellen, ob MDMs zum persistierenden HIV-Reservoir beitragen, also im Laufe der Zeit reproduzierbar reaktiviert werden, haben wir von vier Teilnehmern Längsschnittblutentnahmen durchgeführt (Abb. 3b). Drei Teilnehmer hatten nachweisbare IUPMs (d. h. reaktivierbare Proviren) und einer hatte beim ersten MDM-QVOA ein nicht nachweisbares IUPM. Alle (3/3) Teilnehmer mit reaktivierbarem Provirus bei ihrem ersten Besuch hatten auch bei ihrem zweiten Besuch einen reaktivierbaren Provirus. Es gab keinen signifikanten Unterschied in den IUPM-Werten zwischen den Besuchen 1 und 2 (ein mittlerer Abstand von 265 Tagen). Darüber hinaus hatte der Teilnehmer mit nicht nachweisbarem Virus im MDM-QVOA bei Besuch 1 auch bei Besuch 2 (im Abstand von 146 Tagen) einen nicht nachweisbaren Virus. Als Kontrolle führten wir bei einem Teilnehmer eine zusätzliche CD4-QVOA durch und stellten beim zweiten Besuch einen ähnlichen IUPM-Wert fest (Abb. 3b, orangefarbener CP36-Kreis). Um dies weiter zu testen, wurden zwei Teilnehmer (CP11 und CP21) etwa 3–4 Jahre nach ihrem ersten Besuch ein drittes Mal mit dem MDM-QVOA beurteilt. Beide Teilnehmer erhielten während der gesamten Studie eine supprimierende ART, ohne dass es zu viralen Ausbrüchen kam, und hatten bei ihrem dritten Besuch reaktivierbares Provirus mit ähnlichen Werten wie bei ihren vorherigen Besuchen. Um die Virusfreisetzung zwischen CD4- und MDM-QVOAs zu vergleichen, normalisierten wir den zellulären Input des Assays und bestimmten die HIV-RNA-Kopien pro Million plattierter Zellen. Die mittlere Anzahl der in allen positiven MDM-QVOA-Assays nachgewiesenen HIV-RNA-Kopien betrug 7,2 × 103 Kopien pro Million Zellen (Bereich 1,4 × 103–3,5 × 105 Kopien pro Million Zellen, Abb. 3c) im Vergleich zum CD4-QVOA-Assay mit a Der Median lag bei 1,4 × 105 Kopien pro Million Zellen (Bereich 1,2 × 103–8,9 × 105 Kopien pro Million Zellen), und beide Zahlen unterschieden sich statistisch nicht.

Keines der MDM-QVOAs wies eine wesentliche CD4-Kontamination auf, gemessen durch Durchflusszytometrie vor dem Ausplattieren und TCRβ-RNA nach der Differenzierung (Tabelle 1 und Tabelle 3 mit erweiterten Daten). Von den 16 abgeschlossenen MDM-QVOAs beobachteten wir einen Median von 2,5 % CD4-T-Zell-Kontamination nach der Selektion (Bereich 0,2–25 %; erweiterte Datentabelle 3) und plattierte Zellen, die im Median 75 % TLR2-positiv waren (Bereich 12–94,5). %, TLR2 wird als allgemeiner Marker für Monozyten verwendet23; Erweiterte Datentabelle 3). Die restlichen 25 % bestanden aus kleinen Anteilen an Zelltrümmern, NK- und CD8-T-Zellen, die durch den negativen Selektionstest nicht effizient entfernt wurden. Nach der Differenzierung wurde bei einem Teilnehmer ein erhöhter TCRβ-RNA-Spiegel festgestellt (CP56, 100 CD4 pro Million Zellen; Abb. 2e und Tabelle 1). Allerdings wies dieser Teilnehmer im MDM-QVOA keinen nachweisbaren Virus auf. Alle anderen Teilnehmer hatten einen Median von 0,6 (Bereich 0–37) berechneten CD4-T-Zellen in der größten MDM-QVOA-Vertiefung oder weniger als 13 CD4 pro Million Zellen. Die prozentuale Wahrscheinlichkeit, dass HIV-positive CD4-T-Zellen zu dem in den MDM-QVOAs beobachteten Signal beitragen, lag zwischen 0 und 0,03 %. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass HIV+ CD4 T-Zellen nicht zum im MDM-QVOA beobachteten Signal beitragen. Insgesamt zeigen diese Daten, dass MDMs nicht nur reaktivierbare HIV-Reservoirs enthalten, sondern dass diese Reservoirs im Laufe der Zeit reaktiviert werden können. Dies stützt die Hypothese, dass Monozyten während der Virussuppression und des Rebounds Gewebe aussäen könnten.

Es hat sich gezeigt, dass HIV-gag-DNA-Messungen in CD4-T-Zellen eine Überschätzung des replikationskompetenten Reservoirs darstellen24. Allerdings wurde diese Art der Analyse für das myeloische Reservoir nie abgeschlossen. Daher verglichen wir die bei den Teilnehmern gemessenen HIV-gag-DNA-Kopien pro Million Zellen mit IUPMs oberhalb oder unterhalb der Nachweisgrenze des MDM-QVOA. Wir fanden heraus, dass Teilnehmer mit reaktivierbarem Provirus höhere HIV-DNA-Werte aufwiesen als Teilnehmer mit nicht nachweisbarem Virus (Abb. 3d, P = 0,0122). Um zu beurteilen, ob die HIV-DNA-Spiegel repräsentativ für die Größe des reaktivierbaren Reservoirs waren, korrelierten wir HIV-gag-DNA-Kopien pro Million Zellen und IUPM aus MDM-Assays. Wir fanden heraus, dass DNA und IUPM von MDMs eine schwache positive Korrelation mit einem R2 = 0,47 aufwiesen (Abb. 3e, P = 0,04). Wir verglichen auch die Prozentsätze von CD4-T-Zellen, Monozyten und Monozyten-Untergruppen (klassisch, intermediär und nicht-klassisch) im Vollblut mit dem Ergebnis des MDM-QVOA. Wir fanden heraus, dass es keinen Unterschied zwischen den Prozentsätzen von Monozyten, CD4-T-Zellen oder Monozyten-Untergruppen mit reaktivierbarem Provirus und nicht nachweisbarem Virus in den MDM-QVOAs gab (Abb. 3f, g), was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein einer bestimmten Monozyten-Untergruppe keinen Einfluss hat die Fähigkeit, das Reservoir zu reaktivieren. Insgesamt zeigen diese Daten, dass eine hohe Gesamt-HIV-DNA-Belastung in MDMs die Wahrscheinlichkeit eines MDM-reaktivierbaren Reservoirs erhöht.

Wir wollten herausfinden, ob das im MDM-QVOA produzierte Virus in der Lage ist, CD4-T-Zellen zu infizieren und daher bei Unterbrechung der analytischen Behandlung zur Virusausbreitung beizutragen. Unter Verwendung einer standardisierten Menge HIV (800 Kopien gag-RNA pro ml) aus CD4- und MDM-QVOA-Überständen haben wir aktivierte MT-4 spinokuliert und festgestellt, dass das in MDM-QVOA produzierte Virus in der Lage ist, eine CD4-Zelllinie ähnlich wie ein Virus zu infizieren und zu vermehren Isolate aus CD4-QVOA (Abb. 4a, b). Ein in der Viruskinetik beobachteter Unterschied zwischen Isolaten aus CD4 und MDM-QVOAs bestand darin, dass einige CD4-Isolate exponentiell expandierten, wohingegen MDM-Isolate in Kultur nicht exponentiell replizierten. Bemerkenswert ist, dass es in beiden QVOA-Assays einige Isolate gab, die sich nicht replizierten (CP21 von CD4 und CP25 von MDM). Wir beobachteten eine Vielzahl von Replikationsmustern der MDM- und CD4-Isolate jedes Teilnehmers, wobei diese Muster bereits zuvor in CD4-QVOA25 (Extended Data Abb. 3) berichtet wurden. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass aus reaktivierten MDM-Reservoirs freigesetzte Viren unbeteiligte CD4-T-Zellen infizieren und nach einer Behandlungsunterbrechung zum viralen Wiederanstieg beitragen können.

a,b: QVOA-Kulturüberstände wurden zur Spinokulierung von MT-4s und zur Bestimmung, ob in den QVOAs produzierte Virusisolate zur Ausbreitung fähig sind, verwendet. Dargestellt sind eine repräsentative positive CD4-QVOA-Vertiefung aus 4 vsPWH (a) und eine repräsentative positive MDM-QVOA-Vertiefung aus 5 vsPWH (b); Der Viruseintrag wurde auf 800 Kopien HIV-gag-RNA pro ml normalisiert. c: Das nef-Gen wurde in limitierender Verdünnung aus positiven QVOA-Wells in den CD4- und MDM-Assays sequenziert. Nef-Sequenzen wurden ausgerichtet und ein Baum wurde unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Schätzung unter Verwendung der Bootstrap-Methode generiert, um die Phylogenie zu testen (1.000 Replikationen). Bootstrap-Ergebnisse sind an jedem Teilnehmerknoten gekennzeichnet, >80 wurde als signifikant angesehen. Jede Farbe stellt einen bestimmten Teilnehmer dar, Kreise kennzeichnen CD4-Sequenzen, Quadrate MDM-Sequenzen und Rauten die Referenzsequenz.

Quelldaten

Um festzustellen, ob es in den MDM-Kulturen im Vergleich zu den CD4-Kulturen unterschiedliche HIV-Varianten gibt, sequenzierten wir das nef-Gen sowohl aus MDM- als auch aus CD4-QVOAs von 4 Teilnehmern. Wir fanden heraus, dass MDM-QVOA-Sequenzen wie erwartet mit ihren CD4-Gegenstücken geclustert wurden, da sie aus demselben Individuum isoliert wurden (Abb. 4c), mit Ausnahme von CP25, dessen MDM-Sequenz mit einem anderen Individuum (CP36) im Baum geclustert wurde. Der Bootstrapping-Wert war jedoch nicht signifikant (>80 wurde als signifikant angesehen), was darauf hindeutet, dass diese Sequenz möglicherweise zufällig mit CP36 geclustert ist und eine Ausreißersequenz darstellt. Bei der Beurteilung der Nukleotidsequenz stellten wir außerdem fest, dass das CP25-MDM-Isolat unterschiedliche Mutationen sowohl von CP25-CD4- als auch von CP36-CD4- und MDM-Isolaten aufwies (Extended Data Abb. 4 und 5). Daher kamen wir zu dem Schluss, dass es sich hierbei um eine genaue Sequenz von CP25 MDM-QVOA und nicht um eine Kontaminationsfolge handelte. Dies deutet darauf hin, dass diese Person möglicherweise mit mehr als einem übertragenen Gründervirus infiziert war. Darüber hinaus haben wir nef aus mehreren positiven MDM- und CD4-QVOA-Wells des Teilnehmers CP36 sequenziert. Die Nef-Sequenzen aus den beiden positiven MDM-Wells waren identisch, aber alle CD4-Nef-Sequenzen waren unterschiedlich. Obwohl dies nicht auf Klonalität seitens der MDMs hinweist, da es sich nur um einen Bruchteil der vollständigen Virussequenz handelt, lässt es darauf schließen, dass nef im Vergleich zu CD4s in MDMs konserviert sein könnte, da die Sequenzen aus unabhängigen QVOA-Wells stammten. Diese Daten zeigen, dass die Reaktivierung von MDMs unterschiedliche Viren aus CD4s erzeugen könnte, die vom selben Teilnehmer isoliert wurden.

Anhaltende zelluläre Reservoire latenten HIVs sind ein entscheidendes Hindernis für die Virusausrottung. Unsere Ergebnisse zeigen, dass etwa 40–50 % der vsPWH reaktivierbare latente Viren in MDMs beherbergen, was bemerkenswert ist, da Monozyten bei Heilungsbemühungen außer Acht gelassen werden. Hier haben wir das Monozytenreservoir in vsPWH mithilfe von zwei unabhängigen Techniken quantifiziert: QVOA und IPDA. Der Prozentsatz an vsPWH mit einem Monozytenreservoir ist nur eine Schätzung, da wir aufgrund von Unterschieden in der angeborenen Wahrnehmung von Makrophagen26 und Schwierigkeiten beim Nachweis von HIV-DNA bei Teilnehmern mit geringerer Viruslast27,28,29 möglicherweise nicht in der Lage waren, die von allen Teilnehmern isolierten MDMs optimal zu aktivieren. Darüber hinaus liefern wir Beweise dafür, dass das MDM-Reservoir im Langzeit-vsPWH stabil und beständig ist, da wir das MDM-Reservoir bei denselben Teilnehmern über einen Zeitraum von 9 Monaten bis 4 Jahren gemessen haben. Angesichts der Tatsache, dass zirkulierende Monozyten im Blut eine Lebensdauer von 72 Stunden haben, stützen diese Daten zwei mögliche Hypothesen zur Aufrechterhaltung des myeloischen Reservoirs. Erstens, dass das Knochenmark latente Viren enthält, die Blutmonozyten aussäen. Frühere Studien zeigen, dass HIV hämatopoetische Vorläuferzellen (Knochenmark) in vivo und in vitro infizieren kann und eine aktive zytotoxische Infektion und eine latente Infektion verursacht30,31,32. Dies wird durch die Erkennung reaktivierbarer Viren und Proviren in MDMs im Laufe der Zeit unterstützt. Es deutet auch darauf hin, dass wir im Laufe der Zeit dasselbe Reservoir messen, während neue Monozyten von denselben infizierten Vorläufern stammen. Dies ist ein wenig erforschtes und umstrittenes Thema, da einige Studien auch darauf hinweisen, dass die CD34+-Zellen im Knochenmark kein HIV-Provirus enthalten33 und die Reinigung dieses Zelltyps möglicherweise ein Problem darstellt34. Die zweite Hypothese besagt, dass die laufende Replikation in einem unbekannten Gewebe, möglicherweise der Milz oder dem Lymphknoten, stattfindet, was zu einer anhaltenden Infektion zirkulierender Monozyten führt. Diese Hypothese wird durch die Feststellung gestützt, dass CD16+-Monozyten bevorzugt in vivo und ex vivo infiziert werden35, da es sich hierbei um die Untergruppe von Monozyten handelt, von denen angenommen wird, dass sie Gewebe durchqueren und in den Kreislauf zurückkehren36. Dies wird jedoch durch unsere Daten nicht gestützt, da die Monozyten eine Differenzierung und erhebliche Aktivierung benötigen, um in Kultur Viren zu produzieren, und wir in diesen Zellen keine HIV-RNA nachweisen konnten, was darauf hindeutet, dass das Virus latent ist. Darüber hinaus deuten frühere Studien darauf hin, dass während der ART keine fortlaufende Virusentwicklung im Gewebe stattfindet, was zu erwarten wäre, wenn eine Replikation auf niedrigem Niveau für eine kontinuierliche Monozyteninfektion verantwortlich wäre37,38. Insgesamt sind weitere Studien erforderlich, um festzustellen, wie das Monozytenreservoir aufgebaut und aufrechterhalten wird.

Im Laufe der Jahrzehnte der HIV-Forschung gab es Hinweise darauf, dass myeloische Zellen im latenten Reservoir eine Rolle spielen. Frühe ART-Initiationsstudien berichteten über einen zweiphasigen Zerfall der Virämie im Plasma, wobei die zweite langsamere Phase des Zerfalls auf langlebigere Zellen wie Makrophagen zurückgeführt wurde39,40. Darüber hinaus bleibt HIV in Monozyten und Makrophagen aus Blut und Gewebe bestehen, da HIV-DNA in hochgereinigten Monozyten1,2,3,4,5 und Gewebemakrophagen6,7,8,9,10 von vsPWH nachgewiesen wurde. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte ein neues mechanistisches Verständnis der HIV-Persistenz in Gewebemakrophagen von vsPWH, was darauf hindeutet, dass Stoffwechselwege die Latenz in Makrophagen steuern können41. In Tiermodellen zeigte ein ausschließlich myeloisches Mausmodell von HIV, dass Monozyten und Makrophagen die Infektion unabhängig von CD4-T-Zellen aufrechterhalten können42 und dass HIV während der ART-Unterdrückung in Gewebemakrophagen persistiert43. Makakenmodelle mit unterdrücktem SIV berichten über replikationskompetente myeloische Reservoire im Blut und Gewebe von Tieren, die seit mehr als 20 Monaten unterdrückt wurden15. Darüber hinaus gilt dies nicht nur für HIV, da andere Lentiviren bevorzugt die Wirtsgenome myeloischer Zellen infizieren und sich in diese integrieren, wodurch langlebige Reservoire entstehen44,45. Diese Studien unterstreichen die Bedeutung myeloischer Zellen als HIV-Reservoir, und weitere Studien sind erforderlich, um den Mechanismus zu verstehen, der ihre Persistenz antreibt, und mögliche Strategien für ihre Eliminierung.

Diese Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Zunächst haben wir nur 10 Teilnehmer per MDM-QVOA und 30 Teilnehmer per IPDA analysiert. Daher stellen unsere Ergebnisse möglicherweise keine genaue Darstellung des Prozentsatzes von vsPWH dar, die latentes HIV in Monozyten enthalten. Zweitens haben wir uns nicht mit latent infizierten Gewebemakrophagen befasst, da diese beim Menschen schwieriger zugänglich sind. Zukünftige Studien, die mehr vsPWH, Gewebemakrophagen und detailliertere Sequenzanalysen umfassen, sind erforderlich. Trotz dieser Einschränkungen liefern wir Hinweise darauf, dass Monozyten aus Langzeit-vPWH persistierendes latentes HIV enthalten, das bei Reaktivierung replikationskompetent ist und zur Virusausbreitung fähig ist. Diese Studie liefert direkte Beweise dafür, dass Monozytenreservoirs in die HIV-Heilungsbemühungen einbezogen werden sollten.

Blutproben von gesunden und HIV-positiven Spendern wurden mit schriftlicher Einverständniserklärung entnommen und anschließend gemäß den vom Institutional Review Board der Johns Hopkins University genehmigten Protokollen behandelt. Kohortenmerkmale sind in der erweiterten Datentabelle 1 aufgeführt.

Vollblutproben wurden mit vortitrierten Antikörpern unter Verwendung von 100 μl Vollblut 20 Minuten lang bei Raumtemperatur gefärbt. Das Antikörper-Panel und die Verdünnungen sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Vollblutproben wurden dann lysiert und in 2 ml FACS-Lyselösung (BD Biosciences) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert. Die Proben wurden 5 Minuten lang bei 400 × g in einer Zentrifuge gesammelt, in 2 ml 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann zur Analyse in 0,5 ml PBS resuspendiert. Die Reinheit wurde nach der Selektion mittels Durchflusszytometrie beurteilt. PBMCs wurden vor der Isolierung und nach der Pan-Monozyten-Selektion mit vortitrierten monoklonalen Antikörpern und einem Lebensfähigkeitsindikator gefärbt. Das Antikörper-Panel und die Verdünnungen sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. TLR2 wurde wie zuvor veröffentlicht als allgemeiner Monozyten-Zellmarker verwendet23. PBMCs wurden wie oben beschrieben gefärbt, erfasst und analysiert. Die Auswahlreinheiten sind in der erweiterten Datentabelle 3 angegeben. In ausgewählten Fällen wurden die Reinheitsbewertungen von MDM 7 Tage nach der Differenzierung auch durch Durchflusszytometrie durchgeführt. Von gesunden Spendern differenzierte MDMs wurden mit TrypLE (Gibco) von der Platte entfernt. Das Antikörper-Panel und die Verdünnungen sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Kurz gesagt, die Zellen wurden 30 Minuten lang bei 4 ° C mit Anti-CD3 und LIVE/DEAD gefärbt. Anschließend wurden die Zellen mit Biolegend PermFast permeabilisiert und mit Anti-CD68 oder einer passenden IgG-Kontrolle angefärbt. Die Durchflusszytometrie wurde mit einem BD LSRFortessa (BD Biosciences) durchgeführt. Die Spannungseinstellungen wurden anhand vorgegebener Anwendungseinstellungen in FACSDiva 6.2 auf die täglichen Kontrollen von CS&T Research Bead (BD Biosciences) standardisiert, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzintensität in Längsrichtung konsistent war. Die Daten wurden mit der Software FlowJo 10.0.8 (FlowJo) analysiert. Eine repräsentative Gating-Strategie ist in den erweiterten Daten Abb. 6a – d dargestellt.

Drei Lymphozyten-Zelllinien wurden während der Entwicklung der MDM-QVOA getestet: MT-4-Zelllinie, erhalten durch das NIH HIV Reagent Program, Division of AIDS (NIAID, NIH: MT-4-Zellen, ARP-120, bereitgestellt von Dr. Douglas Richman). (Kat.-Nr. 120)46,47,48); MOLT-4-CCR5 freundlicherweise gespendet von Dr. Robert F. Siliciano von der Johns Hopkins Medical School; und CEMX174, gekauft von ATCC. Alle Zelllinien wurden in R10 (RPMI 1640-Medium (Gibco), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 100 U Penicillin pro ml und 100 µg Streptomycin pro ml) vermehrt und gehalten. Die MOLT-4-CCR5 wurden in Gegenwart von G418 (1 mg ml–1) kultiviert, um die CCR5-Expression aufrechtzuerhalten. Alle Zelllinien wurden mittels Durchflusszytometrie auf die für den HIV-Eintritt notwendigen Rezeptoren und Co-Rezeptoren untersucht. Das Antikörper-Panel und die Verdünnungen sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Die Antikörperfärbung wurde wie oben beschrieben durchgeführt.

Für die PBMC-Isolierung mittels Ficoll-Gradientenzentrifugation wurde Vollblut von virämischen (v) und virussupprimierten HIV-Patienten (vsPWH) gewonnen. Die PBMCs wurden dann in VOAs verwendet, um die geeigneten Bedingungen für die QVOA-Entwicklung zu bestimmen. Alle VOAs wurden an MDMs durchgeführt, die aus frischen, nie gefrorenen PBMCs oder negativ isolierten Monozyten (Pan Monozyten-Isolationskit, menschlich; Miltenyi Biotec) stammten. PBMCs oder isolierte Monozyten wurden mit einer Dichte von 2–5 × 106 Zellen pro Vertiefung ausplattiert und in MDM10 + ARV (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (Life Technologies), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem humanem Typ-AB-Serum (Gemini Bio Products)) kultiviert. , 100 U ml-1 Penicillin-Streptomycin (Life Technologies), 20 μg ml-1 Gentamicin (Life Technologies), 2 mM L-Glutamin (Life Technologies), 2 mM Natriumpyruvat (Sigma), 10 mM HEPES-Puffer (Life Technologies). ) und 50 ng ml-1 rekombinanter menschlicher Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (F&E), der antiretrovirale Medikamente enthält (10 μM Zidovudin (Sigma), 25 nM Darunavir (Janssen) und 5 nM Raltegravir (Merck)). Diese gelten als M0-Bedingungen und führen zu einer Makrophagendifferenzierung ohne Polarisation16. Alle 3 Tage nach dem Ausplattieren wurde die Hälfte des Mediums entfernt und die Kulturen mit frischem MDM10 + ARV aufgefüllt. Monozyten konnten sich unter diesen Bedingungen 7 Tage lang differenzieren. Sobald die MDMs differenziert waren, wurden die Zellen zweimal mit sterilem PBS gewaschen, mit 0,025 % Trypsin behandelt (5 Minuten bei Raumtemperatur) und dann erneut zweimal mit sterilem PBS gewaschen, um sicherzustellen, dass alle kontaminierenden Zellen entfernt wurden und nur anhaftende Zellen in der Kultur verblieben. Die Zellen wurden dann mit MDM10 aktiviert, das eines der folgenden Aktivierungsmittel enthielt: 20 ng ml−1 Tumornekrosefaktor (TNF𝛼, ProSpec), 0,5 µM ml−1 PMA (Sigma) und 10 ng ml−1 Interleukin-4 (IL- 4, Prospekt). Der Kultur wurden Lymphozytenzelllinien zugesetzt, um das aus infizierten Zellen freigesetzte Virus zu vermehren. Die in den VOAs getesteten Zelllinien waren MT-4, MOLT-4-CCR5 und CEMX174 mit einer Dichte von 1 × 106 pro Vertiefung. Zu den Testbedingungen gehörten MDM10 plus ein Aktivierungsreagenz (PMA, TNA oder IL-4) und eine Zelllinie (MT-4, MOLT-4-CCR5 oder CEMx174), MDM10 plus ein Aktivierungsreagenz allein, MDM10 plus eine Zelllinie allein und nur MDM10 . Der Überstand (1 ml) wurde an den Tagen 2, 4, 6, 8, 10 und 12 gesammelt und durch frisches MDM10 ersetzt, das nur das jeweilige Aktivierungsreagenz oder Medium enthielt. Virale RNA wurde zu jedem Zeitpunkt aus 1 ml VOA-Überstand mit dem QIAamp MinElute-Virus-Vakuumkit (Qiagen) gemäß den Empfehlungen des Herstellers isoliert und die Proben wurden durch RT-qPCR wie unten beschrieben auf die Expression von HIV-gag-RNA untersucht.

Hier wird der endgültige Test angegeben, der im gesamten Manuskript verwendet wurde. Menschliche PBMCs aus vsPWH wurden wie oben beschrieben isoliert. Zwei Drittel der isolierten PBMCs wurden für die Isolierung negativer Monozyten verwendet (Pan Monozyten-Isolationskit, menschlich; Miltenyi Biotec) und die restlichen PBMCs waren für den CD4-QVOA-Assay reserviert (Einzelheiten siehe CD4-QVOA-Assay unten). Nach der Pan-Monozyten-Isolierung wurden 5 × 105 Zellen für eine Reinheitsbewertung mittels Durchflusszytometrie beiseite gelegt, 2 × 106 Zellen wurden für T-Zell-Kontrollvertiefungen ausplattiert (1 × 106 pro Vertiefung) und die restlichen Zellen wurden im 5-fachen Duplikat ausplattiert Grenzverdünnung (Abb. 1b). Alle ausplattierten Zellen wurden in MDM10 + ARV (oben beschrieben) kultiviert. Monozyten wurden 7 Tage lang kultiviert, um eine Differenzierung zu MDMs zu ermöglichen. MDM10 + ARV wurde alle 3 Tage gewechselt, um eine Virusausbreitung in der Kultur zu verhindern. Am 7. Tag wurden die MDMs zweimal mit sterilem PBS, einmal mit 0,025 % Trypsin (5 Minuten bei Raumtemperatur) und noch zweimal mit PBS gewaschen, um sicherzustellen, dass alle kontaminierenden Zellen entfernt wurden und nur anhaftende MDMs zurückblieben. MDMs wurden dann mit 0,5 µM ml−1 PMA aktiviert und 1 × 104–106 MT-4-Expanderzellen pro Vertiefung hinzugefügt, mit Ausnahme der T-Zell-Kontrollvertiefungen. Die Überstände wurden gesammelt und alle 3 Tage mit neu hergestelltem MDM10 + PMA aufgefüllt und mittels RT-qPCR auf HIV-gag-RNA untersucht. Überstände von frühen Aktivierungszeitpunkten (Tage 10 und 13) und Überstände von späteren Zeitpunkten (Tage 16 und 19) wurden gepoolt und wie unten beschrieben auf virale RNA untersucht. Die Zellen wurden am 19. Tag gesammelt und in AllPrep-Puffer (RLT plus und 1 % Beta-Mercaptoethanol, βME) zur RNA- und DNA-Isolierung lysiert (siehe unten). Die Häufigkeit von Zellen, die replikationskompetente Viren beherbergen, wurde mit dem Infektionshäufigkeitsrechner IUPMStats v1.0 bestimmt und als IUPM49 ausgedrückt. Wells wurden als positiv angesehen, wenn entweder der frühe oder der späte Zeitpunkt einen Zyklusschwellenwert (Ct) von weniger als oder gleich 35 aufwies, gemessen durch RT-qPCR. Alle MDM-QVOAs wurden mittels RT-qPCR für TCRβ auf CD3+-T-Zell-Kontamination untersucht (siehe unten).

Alle ausgewählten Monozytenproben wurden vor dem Ausplattieren mittels Durchflusszytometrie analysiert, um den Prozentsatz kontaminierender T-Zellen zu bestimmen. Nach der Ausplattierung wurden die Zellen zur weiteren Reinigung durch Adhärenz 7 Tage lang in Gegenwart von ART kultiviert. Sobald die Makrophagen differenziert waren, wurden sie ausgiebig mit PBS und einem geringen Prozentsatz Trypsin gewaschen, um alle nicht anhaftenden Zellen zu entfernen. Zwei Vertiefungen mit mindestens 1 × 106 Monozyten pro Vertiefung wurden als T-Zell-Kontrollen aufbewahrt und es wurden keine MT-4 hinzugefügt. Am Ende des Tests (Tag 19) wurden die Kontrollvertiefungen lysiert und mittels qPCR für T-Zell-Rezeptor-Beta-RNA (TCRβ) auf T-Zell-Kontamination untersucht. Der Zweck der Bestimmung des TCRβ nach der MDM-Aktivierung besteht darin, die Ausbreitung kontaminierender T-Zellen zu ermöglichen und sie leichter erkennen zu lassen. Während der Assay-Entwicklung haben wir auch MDMs mit und ohne Aktivierung auf T-Zell-Kontamination mittels Durchflusszytometrie untersucht und keine kontaminierenden CD3+-Zellen beobachtet (Extended Data Abb. 6e). Darüber hinaus wurden CD4-QVOAs bei derselben Blutabnahme für alle Teilnehmer durchgeführt, um als Positivkontrolle zu dienen. Diese Messungen wurden dann verwendet, um mathematisch die prozentuale Wahrscheinlichkeit einer Kontamination mit HIV+-CD4-T-Zellen im Assay zu berechnen, die zu unserem positiven Signal beiträgt (unten beschrieben und Tabelle 4 mit erweiterten Daten).

Für TCRβ-RNA-Analysen wurden T-Zell-Kontrollvertiefungen ohne MT-4-Zellen verwendet. Während der Assay-Entwicklung haben wir zwei Methoden zum Nachweis von CD3+ T-Zellen in den MDM-Wells getestet: CD3ε und TCRβ. Die CD3ε- und TCRβ-RNA-Expression wurde unter Verwendung der in den Ergänzungstabellen 1 und 2 aufgeführten Primer, Sonden und Reaktionsbedingungen quantifiziert. Alle Proben wurden unter Verwendung zielspezifischer RNA-Standardkurven quantifiziert. Im abschließenden MDM-QVOA-Assay wurde TCRβ verwendet, um die absolute Anzahl der CD3+-T-Zellen in MDM-QVOA abzuschätzen (siehe Tabelle 4 mit erweiterten Daten für Beispiele, wie wir die Anzahl der CD3+-Zellen in den T-Zell-Kontrollvertiefungen berechnet haben). Kurz gesagt, wir haben die Anzahl der TCRβ-RNA-Kopien und die Zellzahl (IFNβ) in derselben Probe ermittelt (über AllPrep isolierte RNA und DNA, siehe unten). Die mittlere Anzahl TCRβ-Kopien pro Zelle wurde unter Verwendung von CD4-T-Zellen, die von 10 gesunden Spendern isoliert wurden, mit 174 bestimmt. Daher haben wir das gesamte TCRβ-Signal durch 174 geteilt, um CD3+-Zellen in der MDM-Vertiefung zu erreichen. Anschließend verwendeten wir die Zellzahl, berechnet durch das IFNβ-Signal dividiert durch 2 (2 Kopien pro Zelle), um die Anzahl der CD3+-Zellen pro Million zu bestimmen. Als nächstes multiplizierten wir die CD3+-Zellen pro Million mit der Anzahl der im größten MDM-QVOA-Well vorhandenen Zellen, da wir dort die meiste Zeit unser positives Signal fanden. Sobald wir die CD3+-Zellen in der größten MDM-QVOA-Vertiefung hatten, multiplizierten wir diese Zahl mit dem Prozentsatz der CD4-T-Zellen im Vollblut zum Zeitpunkt der Entnahme, um zu bestimmen, wie viele CD3+-Zellen auch CD4+-Zellen waren. Anhand dieser Zahl haben wir anhand des CD4-IUPM-Werts derselben Person die Wahrscheinlichkeit berechnet, dass diese Anzahl an CD4-T-Zellen zu unserem positiven Signal beigetragen haben könnte. Die Wahrscheinlichkeit wurde dann mit 100 multipliziert, um die prozentuale Wahrscheinlichkeit abzuschätzen, dass unser Signal von einer HIV-positiven CD4-T-Zelle stammte.

PBMCs wurden aus Vollblut gesunder Spender isoliert und Monozyten wurden mit dem Pan-Monozyten-Selektionskit wie oben beschrieben isoliert. Anschließend wurden Monozyten mit 500.000 Zellen pro Vertiefung ausplattiert und 7 Tage lang unter M0-Bedingungen differenziert. Am 7. Tag wurden die MDMs wie oben beschrieben gewaschen und von zwei HIV+-Spendern (CP11 und 21) isolierte CD4-T-Zellen wurden dreifach in die MDM-Vertiefungen gegeben (Bereich 1 × 104–101 Zellen). Die MDM + HIV + CD4-Kokulturen wurden 12 Tage lang mit und ohne PMA-Aktivierung aufrechterhalten. Am 12. Tag wurden die MDMs gewaschen und lysiert und wie unten beschrieben auf zellassoziierte HIV-RNA und -DNA untersucht.

CD4-QVOA-Assays wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt17. Kurz gesagt, CD4-T-Zellen wurden aus verbleibenden PBMCs unter Verwendung eines negativen CD4-Selektionskits (Neg CD4 Kit, Miltenyi Biotec) isoliert, in einer 5-fachen Grenzverdünnung ausplattiert und in Super-T-Zellmedien kultiviert. Die Zellen wurden mit 0,5 μg ml-1 Phytohämagglutinin (Remel) und 10–2,5 × 106 bestrahlten PBMCs von einem gesunden Spender (Feeder) für mindestens 16 Stunden aktiviert. Anschließend wurde Phytohämagglutinin entfernt und 1–0,5 × 106 MT-4 in jede Vertiefung gegeben. Überstände und Zellen wurden am 7. Tag gesammelt. Die Überstände wurden auf HIV-gag-RNA untersucht und die Zellen wurden in AllPrep-Puffer (RLT plus + βME) zur RNA- und DNA-Isolierung lysiert (siehe unten).

Virale RNA wurde aus 1 ml MDM-QVOA-Überstand aus jeder Reihenverdünnung in zweifacher Ausfertigung unter Verwendung des QIAamp MinElute-Virus-Vakuumkits (Qiagen) gemäß den Empfehlungen des Herstellers isoliert. Virale RNA wurde aus 0,2 ml CD4-QVOA-Überstand mit dem QIAamp MinElute Virus Spin Kit (Qiagen) gemäß den Empfehlungen des Herstellers isoliert. Für alle QVOA-Proben wurde ein DNase-Aufschluss auf der Säule unter Verwendung des RNase-freien DNase-Kits (Qiagen) und 3 U RQ1-DNase (Promega) durchgeführt, und die Säulen wurden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Aus MDM-QVOA- und CD4-QVOA-Überständen isolierte virale RNA wurde mittels RT-qPCR unter Verwendung des QuantiTect-Virus-Kits (Qiagen) bewertet. Primer, Sonden und Reaktionsbedingungen sind in den Ergänzungstabellen 2 und 3 aufgeführt. Zur Kontrolle der DNA-Kontamination wurde eine Reaktion ohne Reverse Transkriptase analysiert. Die Proben wurden mithilfe der HIV-gag-RNA-Standardkurve quantifiziert.

Die zellulären HIV-RNA-gag- und tat/rev-RNA-Gene wurden mit dem AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen) gemäß den Empfehlungen des Herstellers aus Zellen isoliert. Primer, Sonden und Reaktionsbedingungen sind in den Ergänzungstabellen 2 und 3 aufgeführt. Die Proben wurden mithilfe zielspezifischer RNA-Standardkurven quantifiziert.

DNA-Proben wurden mit dem AllPrep DNA/RNA-Minikit gemäß den Empfehlungen des Herstellers aus Zellen isoliert. Virale DNA wurde in den Zellen mithilfe der Multiplex-qPCR mit dem MP-Kit (Qiagen) gemessen. Primer, Sonden und Reaktionsbedingungen sind in den Ergänzungstabellen 2 und 3 aufgeführt. Zur Probennormalisierung und Zellquantifizierung haben wir ein Einzelkopie-Gen, menschliches Interferon-beta (IFN-β), unter Verwendung der in der Ergänzung aufgeführten Primer, Sonden und Reaktionsbedingungen bewertet Tabellen 1 und 2. Die Proben wurden mithilfe zielspezifischer DNA-Standardkurven quantifiziert und durch Eingabe der Zellzahl normalisiert.

Wir führten IPDA wie beschrieben21 durch, um genetisch intakte und defekte (3'-deletierte/hypermutierte und 5'-deletierte) provirale DNA getrennt zu messen, wobei für die Monozytenbewertung geringfügige Modifikationen vorgenommen wurden. Kurz gesagt, TLR2+-Monozyten wurden aus teilnehmenden PBMCs unter Verwendung des Anti-Biotin-Mikrokügelchen-Kits (Miltenyi Biotec) und eines biotinylierten TLR2-Antikörpers (1 μg pro 107 Zellen des Klons TL2.1, Invitrogen) isoliert. Anschließend wurden CD4-T-Zellen mit einem Negativ-CD4-Selektionskit (Neg CD4-Kit, Miltenyi Biotec) aus den verbleibenden TLR2-negativen Zellen isoliert. Ausgewählte Zellen wurden dann mittels Durchflusszytometrie auf ihre Reinheit untersucht (Einzelheiten siehe oben) und zur DNA-Isolierung in AllPrep-Puffer (RLT plus + βME) lysiert (siehe oben). Alle für IPDA verwendeten Primer, Sonden und Reaktionsbedingungen sind in den Ergänzungstabellen 1 und 2 aufgeführt. Die Proben wurden dreifach oder, wenn kein Signal beobachtet wurde, getestet, bis mindestens 1 × 106 Zellen erfasst wurden, wie durch Messung des zellulären Gens bestimmt RPP30. Um das CD4-Signal abzuschätzen, das möglicherweise zu den im Monozyten-IPDA beobachteten Ergebnissen beigetragen hat, verwendeten wir die im CD4-IPDA ermittelten Werte und den durch Durchflusszytometrie bestimmten %CD3+/CD4+-Wert. Wir berechneten mathematisch die Anzahl der in einer Million Monozyten vorhandenen CD4-T-Zellen, das potenziell intakte 3'-del- oder 5'-del-Signal in diesen Zellen und subtrahierten dieses Signal vom Monozyten-IPDA-Signal. Probe 1 enthielt beispielsweise 2 % CD4-T-Zellen in den ausgewählten Monozyten und 10 intakte Genome pro Million CD4-T-Zellen. Wir würden schätzen, dass 20.000 CD4-T-Zellen in 1 × 106 Monozyten (2 x (1 × 106 Zellen) / 100) vorhanden waren und 0,2 intakte Kopien von kontaminierenden CD4s stammten (10 intakte / (1 × 106 Zellen) x 20.000 CD4s). und wir würden dann den letzteren Wert aus dem Monozyten-IPDA-Signal entfernen. Die Monozyten-IPDA-Daten vor und nach der CD4-Anpassung finden Sie in der erweiterten Datentabelle 2. Alle in diesem Manuskript angegebenen Daten sind für CD4 angepasst, jedoch nicht für die DNA-Scherung, um künstliche Erhöhungen der gemeldeten intakten Werte zu verhindern.

MT-4 (2 × 106) wurden mit 500 μl Überstand aus positiven MDM- oder CD4-QVOA-Vertiefungen mit verfügbarer Probe spinokuliert (2 Stunden bei 1.200 × g, Raumtemperatur). Der Viruseintrag wurde für jede Probe auf 800 Kopien von HIV gag normalisiert. Nach der Spinokulation wurden die Zellen einmal mit sterilem PBS gewaschen und in 2 ml R10 resuspendiert, in einer Platte mit 24 Vertiefungen ausplattiert und bei 37 °C inkubiert. Die Überstände wurden an den Tagen 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18 und 21 nach der Spinokulation gesammelt und zu jedem Zeitpunkt durch frisches Medium ersetzt. An den Tagen 6 und 12 nach der Spinokulation wurden alle Kulturen mit zusätzlich 1 × 106 MT-4 ergänzt und die Spinokulation wurde wiederholt. RNA wurde aus 1 ml Probe mit einem QIAamp MinElute-Virus-Vakuumkit (Qiagen) isoliert und HIV-gag-RNA wurde durch RT-qPCR wie oben beschrieben quantifiziert.

DNA wurde aus QVOA-Zellen (MDM und CD4) mit dem AllPrep-Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers extrahiert. PCRs mit limitierender Verdünnung zur Gewinnung von Nef-Klonen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt50,51. Kurz gesagt, DNA wurde in einem verschachtelten PCR-Protokoll mit limitierender Verdünnung unter Verwendung von Platinum Taq HiFi (Life Technologies) verwendet. Die äußeren PCRs wurden 1:3 mit entionisiertem Wasser verdünnt und 10 μl äußere PCR-DNA wurden für die verschachtelte Amplifikation von Nef voller Länge (661 bp) verwendet. Primersätze und Bedingungen sind in den Ergänzungstabellen 1 und 2 aufgeführt und wurden bereits veröffentlicht52. Die Klonalität wurde mithilfe der Poisson-Statistik bestimmt und 2 positive Ergebnisse pro 10 amplifizierten Vertiefungen wurden als klonal angesehen. PCR-Produkte wurden mit 1 % Agarosegelen sichtbar gemacht und mit dem QIAquick-Gelextraktionskit (Qiagen) isoliert. Die Produkte wurden zur Sanger-Sequenzierung geschickt. Contig-Sequenzen wurden mit dem CodonCode-Aligner (v9) generiert, Alignments mit der Bioedit-Clustal-W-Methode (v7.2) und phylogenetische Maximum-Likelihood-Bäume mit der Bootstrap-Methode erstellt, um die Phylogenie bei 1.000 Replikationen über die MEGA-Software (vX) zu testen. Bootstrap-Werte größer oder gleich 80 wurden als signifikant angesehen.

Alle Daten wurden mit Excel (v16.61) und/oder GraphPad Prism (v9.4.1) analysiert und grafisch dargestellt. Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism durchgeführt und waren entweder ungepaarte T-Tests, gepaarte T-Tests oder einfaktorielle Varianzanalysen (ANOVA) mit Tukeys Mehrfachvergleichstest. Korrelationen wurden mithilfe einer einfachen linearen Regression durchgeführt. P ≤ 0,05 wurde als signifikant angesehen. Es wurde keine statistische Methode zur Vorabbestimmung der Stichprobengröße verwendet, es wurden keine Daten von der Analyse ausgeschlossen und es wurde davon ausgegangen, dass die Datenverteilung normal ist, dies wurde jedoch nicht offiziell getestet. Schließlich waren die Forscher während der Experimente und der Ergebnisbewertung nicht blind gegenüber der Zuordnung.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Sequenzierungsdaten aus dieser Studie wurden im NCBI hinterlegt (Zugangsnummern OQ417114 bis OQ417135). Quelldaten werden diesem Dokument in Excel-Form zur Verfügung gestellt.

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Wir danken allen Teilnehmern, ohne die diese Arbeit nicht möglich wäre, dem Johns Hopkins School of Medicine Retrovirus Laboratory für technische Unterstützung und Anleitung und F. Simonetti für seine sorgfältige Durchsicht und Einblicke in das Manuskript. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse P01AI131306 (JEC), R01AI127142 (LG/JEC), R01DA050529 (JEC), R01MH127981 (RTV), R01AI140789 (JNB) und R01MH113512-03S1 (LHR) unterstützt. Zusätzliche Pilotfinanzierung wurde RTV vom National Institute of Mental Health Center for Novel Therapeutics for HIV-associated Cognitive Disorders (P30MH075673) der Johns Hopkins University zur Verfügung gestellt. Diese Forschung wurde durch die Infrastruktur und Ressourcen des Johns Hopkins University Center for AIDS Research, einem vom NIH finanzierten Programm (P30AI094189), erleichtert. PAGC wurde teilweise von der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Finance Code 001 und dem Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq (Proc. 141953/2019-5) finanziert. Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerfassung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Rebecca T. Veenhuis, Celina M. Abreu.

Abteilung für molekulare und vergleichende Pathobiologie, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA

Rebecca T. Veenhuis, Celina M. Abreu, Pedro AG Costa, Edna A. Ferreira, Janaysha Ratliff, Lily Pohlenz, Erin N. Shirk, Leah H. Rubin, Joel N. Blankson, Lucio Gama und Janice E. Clements

Abteilung für Neurologie, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA

Rebecca T. Veenhuis, Leah H. Rubin und Janice E. Clements

Abteilung für Epidemiologie, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA

Leah H. Rubin

Abteilung für Psychiatrie und Verhaltenswissenschaften, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA

Leah H. Rubin

Abteilung für Medizin, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA

Joel N. Blankson

Vaccine Research Center, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA

Lucio Gama

Abteilung für Pathologie, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA

Janice E. Clements

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RTV, CMA, LHR, JNB, LG und JEC haben Experimente entworfen. RTV, CMA, PAGC, EAF, JR, LP und ENS führten Experimente durch. RTV, CMA, JNB, LG und JEC analysierten die Daten. LHR und JNB stellten Materialien zur Verfügung. RTV, JNB und JEC haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Janice E. Clements.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Microbiology dankt Jeremy Luban, Philippe Benaroch und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Die Zelllinien MT-4, CEMx174 und MOLT4-CCR5 wurden auf die Expression der HIV-Eintrittsrezeptoren CCR5, CXCR4 und CD4 untersucht. Die Zellen wurden auf Singuletts und dann auf lebende Zellen untersucht. Das schattierte Histogramm zeigt ungefärbte Zellen, die interessierende schwarze Linienmarkierung.

Vollblut (A), PBMC (B) und negativ selektierte Monozyten (C) eines repräsentativen Probanden wurden verwendet, um zu zeigen, dass eine negative Selektion zu einer geringeren CD4-Kontamination in plattierten Zellen und zu ähnlichen Prozentsätzen der Monozyten-Untergruppen führt. Zellen werden zunächst durch TLR2-Expression gesteuert, Monozyten (TLR2+) werden weiter durch CD14- und CD16-Expression gesteuert, klassisch (CD14 + CD16−), intermediär (CD14 + CD16+) und nicht-klassisch (CD14-CD16+). Lymphozyten (TLR2-) sind Gatter basierend auf der Expression von CD3 und CD4, CD4 T-Zellen (CD3 + CD4+).

Kulturüberstände aus CP11 (A), CP21 (B), CP25 (C) und CP36 (D) positiven MDM- und CD4-QVOA-Vertiefungen wurden zur Infektion von MT-4-Zellen verwendet und die virale Kinetik wurde durch Messung der HIV-RNA im Überstand über die Zeit beurteilt.

Quelldaten

CP25 CD4-A1 (m) wurde als Mastersequenz verwendet, um die anderen CP25-CD4-Sequenzen und zwei repräsentative CP36 CD4- und MDM-Sequenzen mit CP25 MDM-A2 (gelb) zu vergleichen.

Nef-Sequenzen aus positiven MDM- und CD4-QVOA-Wells.

Post-Singulett-Gating-Proben werden auf TLR2 und Side Scatter gesteuert, um Monozyten (TLR2+) von Lymphozyten (TLR2−) zu trennen (A). TLR2+-Zellen werden dann in klassische (CD14 + CD16−), intermediäre (CD14 + CD16+) und nichtklassische (CD14lo/-CD16+) Monozyten-Untergruppen unterteilt (B). TLR2-Zellen werden basierend auf der CD3- und CD159a-Expression (C) getrennt und anschließend anhand der CD4- und CD8-Expression weiter abgegrenzt (D). CD4-T-Zellen werden als (TLR2-CD3 + CD4 + CD8−) gesteuert. (E) MDM mit und ohne Aktivierung für 12 Tage mit PMA wurden mit TrypLE von der Platte entfernt und mit Live/Dead Near IR und mit oder ohne CD3 für 30 Minuten bei 4 °C gefärbt. Die Zellen wurden mit Biolegend PermFast permeabilisiert und mit CD68 oder einer passenden IgG-Kontrolle gefärbt. Die Zellen wurden sofort auf einem BD LSRFortessa laufen gelassen. Die Zellen wurden zunächst umschlossen, um Trümmer zu entfernen, dann um Dubletts zu entfernen und schließlich um tote Zellen zu entfernen.

Ergänzende Tabellen 1–3.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Veenhuis, RT, Abreu, CM, Costa, PAG et al. Von Monozyten abgeleitete Makrophagen enthalten persistente latente HIV-Reservoirs. Nat Microbiol 8, 833–844 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01349-3

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Eingegangen: 26. April 2022

Angenommen: 01. März 2023

Veröffentlicht: 27. März 2023

Ausgabedatum: Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01349-3

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