Diversität und potenzielle pflanzenwachstumsfördernde Fähigkeit samenendophytischer Bakterien des Holoparasiten Cistanche phelypaea (Orobanchaceae)

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11835 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Salzwiesen sind hochdynamische, biologisch vielfältige Ökosysteme mit vielfältigen ökologischen Funktionen. Wir untersuchten die endophytische Bakteriengemeinschaft oberflächensterilisierter Samen des holoparasitischen Cistanche phelypaea, der in Küstensalzwiesen der Iberischen Halbinsel in Portugal wächst. C. phelypaea ist der einzige Vertreter der Gattung Cistanche, der in einem solchen Lebensraum gemeldet wurde. Mithilfe von Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden wurden 23 Bakterienstämme und 263 verschiedene OTUs auf Gattungsebene gefunden. Es dominierten Bakterienstämme der Phyla Proteobacteria und Actinobacteriota. Auch einige neu klassifizierte oder unentdeckte Bakterienstämme, nicht klassifizierte und unerforschte taxonomische Gruppen und symbiotische Archaea-Gruppen bewohnten die Samen von C. phelypaea. γ-Proteobakterien waren die vielfältigste phylogenetische Gruppe. Es wurden 63 Bakterienstämme isoliert, die zu Bacilli, Actinomycetes, α-, γ- und β-Proteobakterien und nicht klassifizierten Bakterien gehören. Wir untersuchten auch die In-vitro-PGP-Merkmale und die Salztoleranz der Isolate. Unter den Actinobakterien sind Micromonospora spp. zeigte die vielversprechendsten Endophyten in den Samen. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Samen von halotoleranten Bakterienstämmen bewohnt waren, die möglicherweise eine Rolle bei der Abschwächung der negativen Auswirkungen von Salzstress auf die Wirtspflanze spielen. In der zukünftigen Forschung sollten diese Bakterien als potenzielle Quellen für neuartige und einzigartige bioaktive Verbindungen oder als neuartige Bakterienarten bewertet werden.

Aufgrund ihrer hohen biologischen Produktivität, ihres Beitrags zu globalen Treibhausgasemissionen und ihrer Beteiligung am Nährstoffkreislauf gelten Feuchtgebiete als äußerst wertvolle Ökosysteme. Salzwiesen sind einzigartige Feuchtgebietssysteme, die durch raue Umweltbedingungen wie periodische Überschwemmungen und hohe Salzgehalte, Nährstoffwerte, Pflanzenfresserdichten und auch einen Anstieg des Meeresspiegels gekennzeichnet sind. Sie beherbergen eine halophile Vegetation1,2. Diese Ökosysteme zeichnen sich durch eine geringe Anzahl vorherrschender Makrophyten mit vorhersehbarer Versauerung und hohem Salzgehalt in der Umwelt aus3. Die in Küstensalzwiesen wachsenden Pflanzen sind eine wenig erforschte Quelle pflanzenassoziierter Bakterien mit einem großen Potenzial für antimikrobielle, enzymatische, pflanzenwachstumsfördernde (PGP) und biologisch abbauende Eigenschaften3. In solchen Salzwiesen ist die holoparasitische Cistanche phelypaea (Orobanchaceae) von besonderem Interesse. Die Gattung Cistanche umfasst etwa 25 Arten und kommt hauptsächlich in trockenen, halbtrockenen und halophytischen Lebensräumen in Eurasien und Nordafrika vor4. Die meisten Arten dieser Gattung benötigen für ihr Wachstum besondere Umweltbedingungen, z. B. extrem trockenes Klima, karge und karge Böden, große Temperaturschwankungen, intensive Sonneneinstrahlung und geringe jährliche Niederschläge5. Der obligate Wurzelparasit C. phelypaea hat ein begrenztes Verbreitungsgebiet und ist in Salzwiesen an der Atlantikküste Portugals und Spaniens endemisch6,7,8.

Im Laufe der Evolution waren obligat wurzelholoparasitische Orobanchaceae zahlreichen Veränderungen unterworfen, z. B. dem Verlust der Wurzeln und Plastiden9,10 und der Produktion einer großen Anzahl extrem kleiner Samen, die viele Jahre lang im Boden lebensfähig bleiben11,12. Das Hauptspeichermaterial in den Samen holoparasitischer Orobanchaceae sind Lipide13. Die entscheidenden Phasen im Lebenszyklus holoparasitischer Pflanzen sind die Samenkeimung, das Erreichen des gewünschten Wirts, der Zugang zu Nährstoffen und die Entwicklung der neuen Generation14. Wenn Wirtssignale empfangen werden, beginnen die Samen zu keimen. Anschließend entwickeln die keimenden Samen spezielle Organe, sogenannte Haustorien, die in das Gefäßsystem des Wirts eindringen. Durch solche Haustoria können holoparasitäre Samen das Wasser und die Nährstoffe des Wirts erreichen15,16.

Bei Wirt-Parasit-Interaktionen stellen die extremen Bedingungen in Salzwiesen eine Herausforderung für beide Partner dar. C. phelypaea parasitiert an Wurzeln halophytischer Pflanzen6. Daher sollte der Holoparasit über Abwehrmechanismen gegen die abiotischen Bedingungen im salzhaltigen Boden und den hohen osmotischen Druck der Bodenlösung verfügen und auch mit der Salztoleranz der Wirtspflanze zurechtkommen können17. Die parasitischen Pflanzen sind sowohl direkt als auch ungerichtet vom Salzstress betroffen. Obwohl die Wurzelparasiten nur sehr begrenzten Bodenkontakt haben, sind sie durch den Stoffwechsel ihres Wirts indirekt von Salzstress betroffen. In natürlichen Lebensräumen bevorzugen die meisten Cistanche-Arten das Wachstum ihrer Wirte unter Stressbedingungen, da die Wirte in solchen Lebensräumen einen hohen Nährstoffgehalt ansammeln18. Salzstress hemmt die Keimung von C. phelypaea-Samen direkt und durch Veränderungen in der Wirtssignalisierung, die stark von der Konzentration der Keimungsstimulanzien abhängt. Die Reaktionsmechanismen der Parasiten auf Salzgehalt sind noch unklar19. Es wurde festgestellt, dass einige Orobanchaceae große Mengen an Polyolen anreichern20. Es wurde berichtet, dass der in Bäumen parasitierende Halbparasit Viscum album (Mistel) aktiv Polyole vom Wirt absorbiert und ein wirtsspezifisches Polyolprofil entwickelt21. Bei höheren Salzkonzentrationen akkumulierte Cuscuta campestris, der Arabidopsis parasitiert, L-Prolin und verringerte auf diese Weise die Salzkonzentrationen im Wirt im Vergleich zu nicht infizierten Pflanzen22.

Pflanzenassoziierte Bakterien spielen eine Schlüsselrolle für die Pflanzengesundheit. Sie können unter rauen abiotischen Bedingungen überleben und den Stoffwechsel des Wirts als Reaktion auf abiotischen Stress stimulieren23. Wie ihre Wirtspflanzen werden diese Mikroorganismen stark vom Salzgehalt der Umwelt beeinflusst24. Es wurde vermutet, dass die Endophyten, die Pflanzensamen besiedeln, in rauen Lebensräumen andere Überlebensstrategien haben als Endophyten von Pflanzen, die auf weniger anspruchsvollen Böden wachsen, und dass sie möglicherweise über einen langen Zeitraum in Samen überleben können25,26. Endophytische Bakterien besitzen häufig PGP-Merkmale wie z. B. die Auxinproduktion27. Es ist erwiesen, dass Vegetationstyp, Pflanzenarten, Kohlenstoff- und Nährstoffverfügbarkeit, Bodentyp und -struktur, abiotische Parameter des Bodens, insbesondere pH-Wert, sowie Bodenfeuchtigkeit einen direkten Einfluss auf die Vielfalt der Mikroorganismen haben, die die Wurzeln besiedeln28,29. Diese Bakterien werden von den Wurzeln auf andere Teile der Pflanze übertragen und gelangen zu den Samen, die von einer Generation zur nächsten als Vektor fungieren30,31. Wie viele Autoren erwähnten, können die Samen von Pflanzen, einschließlich des holoparasitischen C. armena, verschiedene endophytische Bakteriengemeinschaften beherbergen, die an das Überleben unter rauen abiotischen Bedingungen angepasst sind23,26,32. Die einzigartigsten Eigenschaften der samenassoziierten bakteriellen Endophyten sind ihre vertikale Übertragung und ihre Erhaltung in den Samen über einen langen Zeitraum30,33,34. Dies sind wichtige Kapazitäten für den Aufbau und die Etablierung des Endomikrobioms aufeinanderfolgender Samengenerationen, die durchweg ähnliche endophytische Gemeinschaften mit prominenten dominierenden Gruppen aufweisen34.

Obwohl Umwelteinflüsse und anthropogene Faktoren wie Ölverschmutzungen, Stürme oder ein hohes Maß an Eutrophierung für Organismen in natürlichen Salzwiesen eine Herausforderung darstellen, sind die Bakteriengemeinschaften im Allgemeinen recht resistent gegenüber umfassenden Veränderungen der Zusammensetzung35. Andererseits wurde über Unterschiede in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften in den verschiedenen Salzwiesenzonen berichtet2. Es wurde beobachtet, dass dominierende Pflanzenpopulationen, organische Bodensubstanz sowie Phosphor- und Stickstoffkonzentrationen die Abfolge der Bakteriengemeinschaften beeinflussen36. Da der Wurzelparasit vollständig von seiner Wirtspflanze abhängig ist, hängt die mikrobielle Vielfalt des Holoparasiten auch von seiner Wirtsart und den individuellen Pflanzeneigenschaften ab37.

Die pflanzenassoziierte endophytische Mikrobenvielfalt wurde in terrestrischen Ökosystemen besonders gut untersucht. Die Vielfalt und biologische Aktivität mikrobieller Gemeinschaften in Feuchtgebieten ist jedoch immer noch weitgehend unerforscht und konzentriert sich häufig auf die Abwasserbehandlung1,38. Aus der Endosphäre von Mangrovenpropaganda23 und Pflanzenarten, die in salzhaltigen Feuchtgebietsökosystemen wachsen, wurden verschiedene Bakterienstämme isoliert39,40. Die vier wichtigsten Bakterienstämme Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria und Bacteroidetes wurden als dominante Stämme sowohl in terrestrischen als auch in aquatischen Ökosystemen identifiziert23,28,38,41. Diese Bakterienstämme und mehrere Gattungen wie Acinetobacter, Bacillus, Micrococcus, Rhizobium und Staphylococcus werden häufig mit Samen einer Vielzahl von Pflanzentaxa assoziiert33,42,43,44. Diese Endophyten verfügen über eine beträchtliche Toleranz gegenüber einem breiten Spektrum abiotischer Belastungen, die für Küstenumgebungen typisch sind, was auf ihre Anpassungsfähigkeit an diesen besonderen Lebensraum hinweist23.

Spezielle und extreme Umgebungen sind reich an seltenen Actinobakterien und neuartigen Arten. Seltene Actinobakterien sind in der Regel schwer zu isolieren, vor allem aufgrund ihrer besonderen Wachstumsanforderungen und/oder unbekannten Kulturbedingungen45. Von besonderem Interesse sind Aktinobakterien aus Feuchtgebietsökosystemen. Sie produzieren strukturell unterschiedliche bioaktive Komponenten wie Enzyme, Antibiotika, Antitumor- und Immunregulatoren45,46,47. Sie können auch eine wichtige Rolle als Symbionten in pflanzenassoziierten mikrobiellen Gemeinschaften spielen48. Eine große Vielfalt endophytischer Actinobakterien wurde in mehreren Pflanzen identifiziert, die in Mangroven und Salzwiesen an verschiedenen Standorten in Indien (Region Bhitarkanika) und China wachsen (Shankou Mangrove Nature Reserve, Zhanjiang Mangrove Forest National Nature Reserve, Beilum Estuary National Nature Reserve). Zu den am häufigsten vorkommenden Endophyten in Feuchtgebietsökosystemen gehören Streptomyces, Nocardiopsis, Pseudonocardia, Saccharopolyspora, Agrococcus und Micromonospora49,50,51,52. Isolierung, Diversität und biologische Aktivität endophytischer Actinobakterien aus Salzwiesen-Ökosystemen an der Küste werden jedoch noch nicht intensiv erforscht, obwohl solche Umgebungen offenbar einzigartige und phylogenetisch unterschiedliche Endophyten beherbergen53.

Bisher gibt es nur wenige Studien zu samenendophytischen Bakteriengemeinschaften holoparasitischer Pflanzensamen32,54,55. Die endophytische Bakteriengemeinschaft (kultivierbar und nicht kultivierbar) in reifen Samen von C. phelypaea, die in Salzwiesen an der Küste wachsen, wurde noch nicht untersucht. Es gibt nur eine begrenzte Anzahl von Studien zur Biologie und Ökologie von C. phelypaea. Die meisten Arbeiten befassen sich mit der Verbreitung, der Biomasse, dem Wirtsspektrum, dem allelopathischen Potenzial und den ökophysiologischen Wechselwirkungen zwischen C. phelypaea und seinem Wirt6,7,17,56,57,58.

Das Ziel unserer Studie war es, die Vielfalt der endophytischen Bakteriengemeinschaft oberflächensterilisierter Samen von C. phelypaea zu untersuchen, die in iberischen Küstensalzwiesen wachsen. Wir untersuchten auch die In-vitro-PGP-Merkmale der Bakterienisolate, wie die Produktion von Indol, organischen Säuren und Siderophoren sowie die ACC-Desaminaseaktivität.

Wir verwendeten Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden, um die Diversität und Zusammensetzung der bakteriellen Endophytengemeinschaft aus Samen von C. phelypaea zu untersuchen. Die Alpha-Diversitätsindizes (Shannon-Wiener-Biodiversitätsindex, Chao1- und Simpson-Indizes) betrugen 3,12, 165 bzw. 0,868 mit einem P-Wert von 0,05. Insgesamt wurden 263 verschiedene Operational Taxonomische Einheiten (OTU) auf Gattungsebene aus 23 Phyla (> 0,1 %) gefunden. Es wurden auch nicht klassifizierte und unerforschte taxonomische Gruppen gefunden.

In vier Wiederholungen waren Proteobakterien (48,8 %) und Actinobacteriota (43,0 %) die vorherrschenden Phyla. Bacteroidetes (1,2 %) und Firmicutes (5,2 %) wurden nur in zwei bzw. drei der vier Replikate beobachtet (Abb. 1). Andere Phyla machten weniger als 1 % aus. Neben bekannten Bakteriengruppen wurden die Samen auch von neu klassifizierten oder unbekannten Bakteriengruppen besiedelt. Darunter befand sich auch der kürzlich vorgeschlagene Bakterienkandidatstamm Entotheonellaeota. Die anderen speziellen Phyla, die in den Samen von C. phelypaea entdeckt wurden, waren das neu definierte Superphylum Patescibacteria59 und die von Phyl. vorgeschlagenen Phyla Armatimonadetes60 und Desulfobacteriota. 61. Nov. Die C. phelypaea-Samen wurden auch von symbiotischen Archaeen bewohnt, die zu den Nanoarchaeota, Halobacterota und Crenarchaeota gehören.

Relative Häufigkeit (> 1 %) der dominierenden Stämme endophytischer Bakterien in vier DNA-Replikaten (1, 2, 3, 4) von Cistanche phelypaea-Samen.

Von den drei Klassen der Proteobakterien waren die γ-Proteobakterien im Vergleich zu den α- und β-Proteobakterien am vielfältigsten. Es wurden auch nicht klassifizierte Proteobakterien auf verschiedenen taxonomischen Ebenen gefunden. Innerhalb der α-Proteobakterien wurden die Ordnungen Sphingomonadales und Rhizobiales in deutlich höherer Häufigkeit gefunden. Auf der Ordnungsebene wurden γ-Proteobakterien durch Enterobacterales und Pseudomonadales dominiert, und β-Proteobakterien wurden durch Burkholderiales und Neisseriales repräsentiert (Tabelle 1). Der Stamm Actinobacteriota wurde hauptsächlich durch die Ordnungen Propionibakterien mit Cutibacterium auf Gattungsebene und Micromonosporales mit den Gattungen Micromonospora und Microbacterium repräsentiert. Neben bekannten Actinobakterien wurden etwa 8,7 % seltene Actinobakterien62 gefunden: Cryptosporangium, Actinokineospora, Pseudonocardia, Actinoplanes, Kineosporia und Nocardia. Der dritte dominierende Stamm, der in den untersuchten Samen identifiziert wurde, waren schließlich die Firmicutes mit den wichtigsten Ordnungen Lactobacillales und Staphylococcales mit den Gattungen Streptococcus bzw. Staphylococcus. Aus der Ordnung Bacillales waren die Familien Bacillaceae und Planococcaceae vertreten. Detailliertere Informationen zu dominierenden endophytischen Bakterien auf verschiedenen taxonomischen Ebenen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Um einen möglichst vollständigen Überblick über die kultivierbaren Mitglieder der endophytischen Gemeinschaft von C. phelypaea-Samen zu erhalten, wurden verschiedene Kulturmedien ausgewählt. Insgesamt wurden 63 Bakterienstämme, die zu Firmicutes (66,7 %), Actinobacteriota (15,9 %), α-, γ- und β-Proteobakterien (14,3 %) und nicht klassifizierten Bakterien (3,2 %) gehören, aus dem 1/869 reichen Flour1 aufgenommen , PDA-, R2A-, 284- und YEDC-Medien identifiziert und anschließend identifiziert (Tabelle 2). Die morphologischen Eigenschaften von Bakterienkolonien und detailliertere taxonomische Informationen zu isolierten Bakterienstämmen werden in der Ergänzungstabelle S1 und der Ergänzungsabbildung S1 dargestellt.

Die isolierten Stämme wurden auch in vitro auf verschiedene pflanzenwachstumsfördernde (PGP) Eigenschaften getestet, die in Abb. 2 dargestellt sind. 41 (65,1 %) bzw. 37 (58,7 %) aller isolierten Stämme wurden positiv auf die Produktion von Indol getestet ( IAA) und organische Säuren (OA) (Abb. 2a); Unter diesen zeigten die Stämme der Gattungen Ralstonia, Paenibacillus und Peribacillus die höchste IAA-Produktion (Abb. 2b). Unterdessen zeigten die zu Micromonospora, Peribacillus und nicht klassifizierten Stämmen gehörenden Stämme positivere Reaktionen auf die Produktion organischer Säuren (Abb. 2b).

PGP-Aktivität der aus den Samen von Cistanche phelypaea isolierten Stämme. Die Abbildung (A) zeigt die Produktionsfähigkeit von IAA, ACCD, Siderophoren und organischen Säuren. positiv-rot, negativ-grau. (B) Abbildung zeigt IAA (rot), ACCD (blau), Siderophore (grau) und organische Säuren (hellbraun).

Sowohl für die ACC-Desaminase- als auch für die Siderophorproduktion wurden 20 (31,7 %) bzw. 21 (33,3 %) der untersuchten Stämme positiv getestet (Abb. 2a); darunter waren 75 % der Micromonospora und 100 % der Ralstonia positiv hinsichtlich der Produktion von Siderophoren. Im Fall der ACC-Deaminase wurden die meisten positiven Reaktionen bei Stämmen gefunden, die zu Micromonospora, Ralstonia und Paenibacillus gehören (Abb. 2b). Unter den β-Proteobakterien sind Ralstonia spp. zeigte die höchste Anzahl positiver Reaktionen für die Siderophorproduktion. Unter den Actinobakterien sind Micromonospora spp. zeigten bei allen getesteten PGP-Merkmalen gleich hohe positive Reaktionen (Abb. 2b). Detaillierte Informationen zu den In-vitro-PGP-Merkmalen finden Sie in der Ergänzungstabelle S1 und der Ergänzungsabbildung S1.

Um die Salztoleranz der isolierten Stämme zu bestätigen, wurde die modifizierte Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI)63 verwendet. Nach 7–10 Tagen Beobachtung zeigten alle getesteten Bakterienstämme Salztoleranz (ergänzende Abbildung S1).

Salzwiesen sind natürliche Lebensräume für viele einzigartige salztolerante Pflanzen64. Unter diesen ist der holoparasitische C. phelypaea hervorzuheben. Der heterotrophe Lebensstil parasitärer Pflanzen führte zu mehreren morphologischen, physiologischen und molekularen Anpassungen mit einzigartigen Eigenschaften, die sie zu einer spannenden Gruppe für Studien machen; Beispiele hierfür sind die Produktion einer großen Anzahl sehr kleiner Samen und die sehr spezifischen Keimbedingungen. Darüber hinaus haben sie erhebliche Auswirkungen auf die Ökosysteme, in denen sie vorkommen15. Die Bedeutung von Feuchtgebieten, insbesondere Salzwiesen, und das begrenzte Wissen über die Mikrobiologie solcher Systeme bilden den Anlass für die vorliegende Arbeit, die sich auf die samenassoziierte endophytische Bakteriengemeinschaft des obligaten Wurzelparasiten C. phelypaea konzentriert, der an den Wurzeln parasitiert halophytische Pflanzenarten6.

In einer aktuellen Studie32 untersuchten wir das Bakteriensamen-Endomikrobiom einer anderen Art aus der Gattung Cistanche, C. armena, einer endemischen Art, die in salzhaltigen und trockenen Lebensräumen in Armenien wächst. Die samenendophytische Bakteriengemeinschaft von C. armena ist im Vergleich zu der von C. phelypaea weniger vielfältig und besteht hauptsächlich aus sporenbildenden, halophytischen Bakterien, wobei die Firmicutes der vorherrschende Stamm sind (60,4 %) (Tabelle 3). Aus den Samen von C. armena wurden 10 Bakterienstämme und 256 Gattungen identifiziert. Die Struktur und Vielfalt dieser endophytischen Bakteriengemeinschaft hängt mit dem natürlichen Lebensraum ihrer Wirtspflanze zusammen32.

In der vorliegenden Studie beschreiben wir die Struktur und Vielfalt der endophytischen Bakteriengemeinschaft von Samen einer endemischen C. phelypaea-Population, die in Küstensalzwiesen in Portugal wächst. Proteobakterien, Actinobacteriota, Firmicutes und Bacteroidetes sind in oberflächensterilen Samen gut vertreten (> 1 %) (Abb. 1). Entsprechende Ergebnisse wurden für die Samen anderer holoparasitischer Orobanchaceae-Arten, C. armena32 und Phelypanche ramosa54, berichtet.

Neben allgemein bekannten Bakteriengruppen werden die Samen von C. phelypaea auch von neu klassifizierten oder unerforschten Bakterienstämmen besiedelt, über die in solchen Samen bisher nicht berichtet wurde. Zu diesen gehören Entotheonellaeota, die bisher hauptsächlich in Verbindung mit Meeresschwämmen gefunden wurden. Bei den aus dem Meeresschwamm Theonella swinhoei Y isolierten Bakterien handelt es sich um unkultivierte filamentöse Bakterien „Candidatus Entotheonella Factor“ und „Candidatus Entotheonella Gemina“. Gesamtgenomsequenzierung von Ca. Entotheonella zeigte ein außerordentlich reiches genomisches Potenzial für die Produktion bioaktiver Naturstoffe mit einzigartigen Strukturen, ungewöhnlicher biosynthetischer Enzymologie und weitgehend unbekannten Eigenschaften65. Ein weiteres interessantes, neu definiertes Superphylum Patescibacteria wurde im Grundwasser, in Sedimenten, Seen und anderen aquatischen Umgebungen gefunden und wurde auch in Verbindung mit Pflanzen gefunden59,66. Die Rolle von Patescibakterien in Pflanzen ist noch unklar, obwohl sie im Gewebe verschiedener Pflanzen, in pflanzenassoziierten Böden und beim Abbau pflanzlicher Biomasse entdeckt wurden60,66. Es wird angenommen, dass der Stamm Armatimonadetes Stämme beherbergt, die in großem Umfang am Abbau von Pflanzenmaterial beteiligt sind, d. h. Substanzen, die auf Polysacchariden basieren60.

Mit 48,8 % ist der Stamm Proteobakterien in den Samen von C. phelypaea am häufigsten vertreten (Abb. 1, Tabelle 3). In Samen von C. armena dominierten Firmicutes (60,4 %), gefolgt von Proteobakterien mit 32,9 % (Tabelle 3). In Samen von C. phelypaea waren unter den Proteobakterien die γ-Proteobakterien vielfältiger als die α- und β-Proteobakterien (Tabelle 1). Im Vergleich dazu kamen in den Samen von C. armena nur γ-Proteobakterien mit den dominierenden Ordnungen Xanthomonadales, Pseudomonadales und Enterobacterales vor32. Die dominierenden γ-Proteobakterien in Samen von C. phelypaea waren Pseudomonadales und Enterobacterales. Auf Familienebene waren Morganellaceae, Aeromonadaceae, Shewanellaceae, Pseudomonadaceae und Moraxellaceae am häufigsten (Tabelle 1). Klassen von Proteobakterien zeigten unterschiedliche Verbreitungstendenzen in verschiedenen Ökosystemen. In Sedimenten mariner Feuchtgebietsökosysteme wurde über eine weite Verbreitung von γ-Proteobakterien berichtet, und die meisten von ihnen schienen an der Schwefelreduktion beteiligt zu sein67. In Süßwassersedimenten traten jedoch zahlreiche α- und β-Proteobakterien auf; Dies sollte mit dem pH-Wert und den Nährstoffen korrelieren68.

Der zweithäufigste Bakterienstamm in Samen von C. phelypaea waren die Actinobacteriota mit einer mehr oder weniger ähnlichen Häufigkeit wie die Proteobakterien (43,0 % gegenüber 48,8 %). Dies unterscheidet sich von den Samen von C. armena, in denen Actinobacteriota nur 6,5 % ausmachte (Tabelle 3). Die Häufigkeit dieses Stammes in den untersuchten Samen ist nicht unerwartet, wenn man den Lebensraum berücksichtigt, in dem C. phelypaea wächst. Actinobacteriota wurden in der Tat häufiger als der charakteristischste Stamm in Feuchtgebietsökosystemen beschrieben1,3,45,47,48. Bis heute sind die Gemeinschaftsstruktur, die Diversität, die biologischen Aktivitäten und die Mechanismen der Umweltanpassung von Actinobakterien an spezielle und extreme Umgebungen im Vergleich zu gemäßigteren und terrestrischen Umgebungen nur unzureichend untersucht69. In Samen von C. phelypaea war Micromonospora (38,1 %) die am häufigsten vorkommende Gattung der Actinobacteriota. Die Gattungen Microbacterium und Curtobacterium waren auch dominierende Gattungen in Samen von C. armena, die in einer salzhaltigen, extrem trockenen Umgebung in Armenien wuchsen32. Es scheint, dass Curtobacterium eine flächendeckende Verbreitung hat und sowohl in feuchten als auch in trockenen Ökosystemen vorkommt. In vielen Studien wurde erwähnt, dass Curtobacterium ein Krankheitserreger wirtschaftlich wichtiger Pflanzen ist70. Darüber hinaus ist bekannt, dass diese Gattung ein äußerst vielfältiges genomisches Potenzial für den Kohlenhydratabbau aufweist, insbesondere im Hinblick auf strukturelle Polysaccharide71.

Die Samen von C. phelypaea werden auch von seltenen Actinobakterien besiedelt: Actinoplanes, Actinokineospora, Cryptosporangium, Kineosporia, Nocardia, Pseudonocardia. Diese Bakterien lassen sich relativ schwer isolieren und in vitro kultivieren, da es schwierig ist, die Bedingungen ihrer natürlichen Lebensräume nachzuahmen. Seltene Actinobakterien wurden aus verschiedenen Umgebungen isoliert: der Tiefsee, Wüsten, Mangroven, Pflanzen, Höhlen, Vulkangestein und Steinen, was ihre weite Verbreitung in der Biosphäre verdeutlicht72. Wie mehrere Autoren berichten, sind solche Bakterien eine potenzielle Quelle für neuartige bioaktive Verbindungen. Daher ist es wichtig, unser Wissen über ihre Vielfalt und Verbreitung in der Umwelt zu erweitern46,60.

Bei C. armena-Samen war Firmicutes mit einer Gesamthäufigkeit von 60,5 % der vorherrschende Stamm (Tabelle 3). Die isolierten Firmicutes gehörten zu den Gattungen Paenibacillus (28 %), Bacillus (41,9 %) und einigen anderen Gattungen (11,8 %)32. Durch die Verwendung verschiedener Wachstumsmedien konnten wir eine recht große Vielfalt an Bakterienstämmen aus oberflächensterilisierten Samen von C. phelypaea isolieren und kultivieren (Tabelle 2). Obwohl die Gesamthäufigkeit von Firmicutes in Samen von C. phelypaea recht gering war (5,2 %), gehörte ein Großteil der kultivierbaren Bakterienstämme zu diesem Stamm (66,7 %), gefolgt von Actinobacteriota (15,9 %), α-, γ- und β-Proteobakterien (14,3 %) und nicht klassifizierte Bakterien (3,2 %) (Tabellen 2, 3).

Die potenziellen PGP-Merkmale und die Salztoleranz von 63 isolierten Bakterienstämmen wurden untersucht (Abb. 2). Es wird oft behauptet, dass solche PGP-Merkmale, z. B. die Produktion von Siderophoren, ACC-Desaminase, Salicylsäure und Phytohormonen wie Auxinen, Gibberellinen, Zytokininen und Abscisinsäure, Teil der Mechanismen sind, die Pflanzen dabei helfen, mit abiotischem Stress umzugehen73,74,75 .

Basierend auf In-vitro-Tests scheinen die ausgewählten Bakterienisolate mehrere pflanzenwachstumsfördernde Eigenschaften zu besitzen. 58,7 % der isolierten Stämme verschiedener Gattungen produzierten organische Säuren (OA) und auch 65,1 % zeigten die Fähigkeit, IAA zu produzieren (Abb. 2a). Unter den Bakterienstämmen der Gattungen Ralstonia und Peribacillus zeigten die meisten positiven Reaktionen bei der In-vitro-IAA-Produktion. Bei organischen Säuren wurden die meisten positiven Reaktionen bei Micromonospora, Peribacillus und nicht klassifizierten Bakterien gefunden (Abb. 2b). Die Produktion von IAA und organischen Säuren durch viele der aus Küstensalzwiesen stammenden Samenendophyten (30–35 % Salzkonzentration) war zu erwarten, da die aus C. armena aus ariden und salzhaltigen Lebensräumen isolierten Samenendophyten ebenfalls hohe IAA-Werte aufwiesen und Produktion organischer Säuren32. In der vorliegenden Studie produzieren 65,1 % bzw. 58,7 % der Isolate IAA bzw. organische Säuren. Unterdessen zeigten Petrosyan et al.32, dass die meisten Bakterienstämme, die aus den oberflächensterilisierten Samen von C.armena isoliert wurden, auch IAA (80,7 %) und organische Säuren 51,6 % produzieren konnten (Abb. 3). Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass IAA-produzierende halotolerante Bakterien die Toleranz von Pflanzen gegenüber salzhaltigen Bedingungen erhöhen. Die Produktion organischer Säuren durch Rhizosphären-Mikroorganismen ist einer der Mechanismen zur Solubilisierung von Phosphor (P), der in unlöslichen Mineralverbindungen im Boden enthalten ist76. Insgesamt sind die Samen beider Cistanche-Arten von halotoleranten Bakterien besiedelt, die möglicherweise eine Rolle dabei spielen, die negativen Auswirkungen von Salzstress in der holoparasitischen Pflanze zu mildern. Es ist jedoch immer noch nicht klar, ob die PGP-Merkmale dieser Bakterien nur für den Holoparasiten oder auch für seine Wirtspflanze von Vorteil sind. Es bleibt auch unklar, ob die PGP-Kapazitäten von Samenendophyten den Embryo des Holoparasiten vor Salzstress schützen können.

PGP-Merkmale endophytischer Bakterienstämme (%), die aus den oberflächensterilen Samen von Cistanche armena und C. phelypaea isoliert wurden.

Die ACC-Deaminasekapazität ist ein weiteres wichtiges Merkmal von PGP-Endophyten. Viele halophytische Pflanzen (Salicornia europaea, Halimione portulacoides, Prosopis strombulifera und Limonium sinense) werden von Endophyten mit ACC-Deaminase-Kapazität besiedelt77. ACC-Deaminase kann die Ethylenproduktion unter Salzstress senken. Tatsächlich wandeln Endophyten mit ACC-Desaminase-Kapazität ACC (1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure, die unmittelbare Vorstufe von Ethylen in Pflanzen) in a-Ketobutyrat und Ammoniak um, was den Pflanzen hilft, die negativen Auswirkungen von Salzstress auf die Wurzelentwicklung zu reduzieren77. Die Hauptfolgen von Salzstress sind Nährstoffungleichgewichte und negative Auswirkungen auf die Pflanzenphysiologie im Allgemeinen. Siderophore sind Eisenchelatbildner mit hoher Affinität. Eisen ist ein Mikronährstoff, der für das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen unerlässlich ist, da es ein wesentlicher Co-Faktor für eine Vielzahl von Reaktionen im Pflanzenzellstoffwechsel und bei Enzymen ist, die Eisen benötigen. Es ist Teil mehrerer Metalloenzyme, die an der Photosynthese und Atmung beteiligt sind. In salzhaltigen Böden ist die Bioverfügbarkeit von Fe für Pflanzen gering. Die Rolle mikrobieller Siderophore bei der Fe-Versorgung von Pflanzen und bei der Minderung von Salzstress im Pflanzenwachstum ist gut dokumentiert78. 33,3 % bzw. 31,7 % der isolierten Bakterienstämme wurden positiv auf Siderophor- und ACC-Desaminase-Produktion getestet (Abb. 2a). Im Vergleich zu C. armena waren 16,1 % positiv für Siderophor und 42 % positiv für ACC-Deaminase (Abb. 3). Die meisten positiven Reaktionen wurden bei Actinomycetia und β-Proteobakterien beobachtet. Es scheint, dass β-Proteobakterien mit Ralstonia spp. haben eine hohe Siderophor-Produktionskapazität (Abb. 2b). Sphingomonas spp. (α-Proteobakterien) zeigten bei allen in vitro getesteten PGP-Merkmalen die geringsten positiven Reaktionen. Ganz ähnliche Ergebnisse wurden bei der Produktion von Indol und organischen Säuren beobachtet. Auch eine ähnliche Anzahl von Endophyten erzielte positive Ergebnisse bei der ACC-Desaminase- und Siderophorproduktion (Abb. 2a). Unter den Actinobakterien sind Micromonospora spp. zeigten die positivsten Reaktionen auf die in vitro getesteten PGP-Merkmale und könnten daher als potenziell günstigste Endophyten in C. phelypaea-Samen angesehen werden. Janibacter-Stämme, die ebenfalls zu den Micrococcales gehören, erzielten bei allen getesteten PGP-Tests negative Ergebnisse (Ergänzungstabelle S1).

Der holoparasitische C. phelypaea, der halophytische Wirtspflanzen parasitiert, ist der einzige Vertreter der Gattung Cistanche, der in Salzwiesen an der Küste Portugals vorkommt. Wir haben die samenendophytische Bakteriengemeinschaft dieses Holoparasiten untersucht. Es gelang uns, 63 Bakterienstämme zu isolieren, während mithilfe der Illumina-Paired-End-Sequenzierung 263 verschiedene Bakteriengattungen aus 23 Bakterienstämmen als Samenendophyten von C. phelypaea identifiziert wurden. Die 63 kultivierbaren Stämme schienen salztolerant zu sein und pflanzenwachstumsfördernde Eigenschaften wie die Produktion von organischen Säuren, IAA, Siderophoren und ACC-Desaminase zu besitzen. Die Gattung Micromonospora beherbergte die nützlichsten Bakterien. Diese halotoleranten Bakterien haben das Potenzial, die negativen Auswirkungen von Salzstress auf den Holoparasiten zu mildern. Möglicherweise schützen sie auch den Embryo des Holoparasiten vor Salzstress und halten die Samen lange lebensfähig. Um dies zu bestätigen, sind jedoch weitere Studien zu den positiven Auswirkungen von PGP-Samenendophyten auf den Holoparasiten erforderlich. Darüber hinaus stellen die Samen von C. phelypaea ein noch wenig erforschtes Reservoir an vielfältigen und neuartigen endophytischen Actinobakterien dar, die für die Entdeckung neuer bioaktiver Verbindungen von potenziellem Interesse sein könnten.

Der holoparasitische Cistanche phelypaea (L.) Cout. (Orobanchaceae) kommt an der Atlantikküste der Iberischen Halbinsel, in Portugal und Spanien7 vor. Reife Samen wurden an sandigen Ufern am Rande einer Salzwiese in Portugal, Region Algarve, im südwestlichen Teil von Alvor, in der Mündung des Rio de Alvor in den Atlantischen Ozean, etwa 10 m über dem Meeresspiegel (37°) gesammelt 07′ 48,0′′ N, 8° 37′ 12,0′′ W). Die Küste der Algarve ist geschützter mit durchschnittlichen Höchsttemperaturen im Sommer von etwa 25–28 °C und im Winter von minimalen 11,5 °C. Die durchschnittliche jährliche Niederschlagsmenge beträgt etwa 500 mm. Das Gebiet ist eine euhaline Küstenlagune mit einem Salzgehalt von 30 bis 35 % und sandig-schluffigen Zonen, die regelmäßig überschwemmt wird und aus Salzwiesen an der Küste besteht79. Es dominiert eine halophytische Pflanzengemeinschaft, zu der die C. phelypaea-Wirtsarten Arthrocnemum Macrostachyum (Amaranthaceae), Sarcocornia fruticose (Amaranthaceae), Suaeda vera (Amaranthaceae) und Limoniastrum monopetalum (Plumbaginaceae) gehören6 (Abb. 4). Die Iberische Halbinsel gilt als Hotspot-Gebiet der Artenvielfalt mit einem hohen Endemismusniveau80. Die Ria de Alvor ist eigentlich ein vorrangiges Schutzgebiet, ist Teil des Europäischen Ökologischen Netzwerks Natura 2000 und seit 1996 ein RAMSAR-Feuchtgebiet von internationaler Bedeutung64.

Allgemeiner Habitus der untersuchten Arten und ihre Lebensräume: (a,b) Cistanche phelypaea in den Küstensalzwiesen in Portugal. Fotos von R. Piwowarczyk.

Reife und trockene Samen von C. phelypaea wurden im April 2012 aus reifen Früchten von mindestens 10 einzelnen Pflanzen der Gesamtpopulation am genannten Standort gesammelt. Die Arten wurden von Renata Piwowarczyk gesammelt und identifiziert. Die Herbariummaterialien wurden im Herbarium der Jan-Kochanowski-Universität in Kielce (KTC), Polen, hinterlegt. Vaucher-Exemplare im Herbarium KTC sind noch nicht nummeriert. Die Herbariummaterialien werden bei einer stabilen Temperatur von etwa 20 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 30 % gelagert. Bei den Feldstudien und der Sammlung von Pflanzen- und Saatgutmaterial wurden die relevanten lokalen, institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien, Genehmigungen oder Gesetze eingehalten und die erforderlichen Genehmigungen eingeholt.

Ziel der Samenoberflächensterilisation ist es, ausschließlich endophytische Bakteriengemeinschaften (kultivierbar und nicht kultivierbar) zu erhalten. Die Oberflächen von Cistanche-Samen weisen eine alveolenförmige Ornamentskulptur mit polygonalen und isodiametrischen Zellen unterschiedlicher Größe auf81. Ein effizientes Sterilisationsprotokoll ist von entscheidender Bedeutung. Zu diesem Zweck wurden die von Petrosyan et al.32 beschriebenen Techniken zur Sterilisation der Samenoberfläche verwendet. Die Effizienz des Sterilisationsverfahrens wurde durch Ausplattieren von 100 µl des letzten Spülwassers auf 869-reiches Medium82 überprüft. Anschließend wurden die oberflächensterilisierten Samen in 0,5 ml 10 mM MgSO4-Lösung unter Verwendung eines sterilen Pelletstößels (Kimble®) mechanisch homogenisiert. Der Homogenisierungsprozess wurde unter Verwendung von 5–6 Metallkügelchen aus rostfreiem Stahl (2,8 mm) und einer zweiflügeligen Mischmühle (Retsch MM400, Deutschland) für 15 Minuten bei 25 Hz durchgeführt. Ein Teil der homogenen Suspension wurde zur DNA-Extraktion bei −80 °C gelagert, ein anderer Teil wurde zur Isolierung kultivierbarer Bakterien verwendet (siehe unten).

Zur Isolierung und Identifizierung der gesamten (kultivierbaren und nicht kultivierbaren) Bakteriengemeinschaft wurde die homogenisierte Suspension der oberflächensterilisierten Samen verwendet. Die DNA-Isolierung wurde in 4 Replikaten unter Verwendung des Mobio PowerPlant-Protokolls basierend auf dem PowerPlant® Pro DNA Isolation Kit und der patentierten Lösung (Inhibitor Removal Technology® IRT) zur Entfernung von PCR-Inhibitoren aus Pflanzenextrakten während des Isolierungsprozesses durchgeführt.

Alle isolierten DNA-Proben wurden einer bakteriellen 16S-rRNA-Gen-Amplikon-PCR unterzogen. In der ersten Runde der 16S-rRNA-Gen-PCR wurde unter Verwendung der Primer 515F-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA und 806R-GGACTACNVGGGTWTCTAAT83 ein Amplikon von 291 bp mit einer Illumina-Adapterüberhang-Nukleotidsequenz erzeugt, was zu den folgenden Sequenzen führte: 515F-Adapter: 5′-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG-3′ und 806R-Adapter: 5′-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA G-3′. Für die erste Runde der Polymerasekettenreaktionen (PCR) wurde das Q5 High-Fidelity DNA Polymerase System (M0491, NEB) verwendet. Die 16S-rRNA-Gen-PCR wurde in 25-μl-Volumina durchgeführt, die 1 μl extrahierte DNA, 1 × Q5-Reaktionspuffer mit 2 mM MgCl2, 200 μM dNTP-Mischung, 1 × Q5 High GC Enhancer, 0,25 μM Vorwärts- oder Rückwärtsprimer und 0,02 U μl enthielten 1 Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase, 0,5 μl MitoPNA-Blocker (2 μM Endkonzentration hinzugefügt aus einer 50 μM-Stammlösung) und 0,5 μl PlastidPNA-Blocker pro Probe84. Zu den Thermocycling-Bedingungen gehörten eine anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 3 Minuten, eine Denaturierung bei 98 °C für 10 Sekunden, ein Tempern bei 56 °C für 30 Sekunden und eine Verlängerung bei 72 °C für 30 Sekunden. Alle drei Schritte wurden insgesamt wiederholt 35 Zyklen und abschließend 7 Min. Verlängerung bei 72 °C. Die Reaktion wurde durch Abkühlen auf 4 °C beendet. Die amplifizierte DNA wurde mit den AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter) und dem MagMax-Magnetpartikelprozessor (ThermoFisher, Leuven, Belgien) gereinigt. 5 μl des gereinigten PCR-Produkts wurden für die zweite PCR zur Anbringung der Nextera-Indizes verwendet. Die Indizierung wurde mit dem Nextera XT™-Bibliotheksvorbereitungskit (Nextera XT Index Kit v2 Set A (FC-131-2001) und D (FC-131-2004), Illumina, Belgien) durchgeführt. Für diese PCR-Reaktionen wurden 5 μl davon verwendet Das gereinigte PCR-Produkt wurde in einem Reaktionsvolumen von 25 μl verwendet und gemäß dem 16S Metagenomic Sequencing Library Prepared Guide vorbereitet. Die PCR-Bedingungen waren die gleichen wie oben beschrieben, aber die Anzahl der Zyklen wurde auf 20 und die Annealing-Temperatur auf 55 °C reduziert. PCR Die Produkte wurden mit dem Agencourt AMPure XP-Kit gereinigt und dann im Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen) quantifiziert. Die Bibliotheken wurden vor der Sequenzierung auf dem Illumina MiSeq in äquimolaren Konzentrationen auf 4 nM unter Verwendung von 10 mM Tris pH 8,5 gepoolt. Die Proben wurden mit sequenziert das MiSeq Reagent Kit v3 (600 Zyklen) (MS-102-3003) und 15 % PhiX Control v3 (FC-110-3001). Zur Qualitätskontrolle ein DNA-Extraktions-Blindwert, ein PCR-Blindwert und ZymoBIOMICS Microbial Mock Community Standard (D6300). ) zur Prüfung der Effizienz der DNA-Extraktion (Zymo Research) wurden in den gesamten Prozess einbezogen.

Die Sequenzen wurden mit der Illumina Miseq-Software demultiplext und anschließend mit DADA2 1.10.185 in R Version 3.5.1 auf Qualität getrimmt und Primer entfernt. Die Parameter für die Längenkürzung wurden so eingestellt, dass die ersten 290 Basen des Vorwärts-Reads und 200 Basen des Reverse-Reads erhalten bleiben, maxN = 0, MaxEE = (2,5) und PhiX-Entfernung. Fehlerraten wurden abgeleitet und die gefilterten Lesevorgänge wurden unter Verwendung der DADA2-Standardparameter derepliziert und entrauscht. Nach dem Zusammenführen gepaarter Lesevorgänge und dem Entfernen von Chimären über die RemoveBimeraDenovo-Funktion wurde eine Amplikon-Sequenzvariantentabelle (ASV) erstellt und die Taxonomie mithilfe des SILVA v138-Trainingssatzes86,87 zugewiesen. Die resultierenden ASVs und Taxonomietabellen wurden mit der Metadatendatei in einem Phyloseq-Objekt (Phyloseq, Version 1.26.1)88 kombiniert. Kontaminanten wurden mithilfe des Pakets Decontam (Version 1.2.1) aus dem Datensatz entfernt, wobei die Prävalenzmethode mit einem Schwellenwert von 0,5 angewendet wurde89. Ein phylogenetischer Baum wurde mithilfe einer DECIPHER/Phangorn-Pipeline wie zuvor beschrieben90 erstellt.

Die ASV-Tabelle wurde weiter verarbeitet, indem Organellen (Chloroplasten, Mitochondrien) entfernt wurden, und die Prävalenz wurde mithilfe einer Einschlussschwelle von 2 % (unüberwachte Filterung) gefiltert, wie von Callahan85 beschrieben. Alpha-Diversitätsmetriken wie die Diversitätsindizes von Chao1, Simpson und Shannon wurden anhand ungefilterter Daten mithilfe von Skripten aus dem MicrobiomeSeq-Paket berechnet. Hypothesentests wurden mithilfe der Varianzanalyse (ANOVA) und der Tukey Honest Significant Differences-Methode (Tukey HSD) durchgeführt. Wenn die Annahmen über Normalität und Homoskedastizität nicht erfüllt waren, wurden ein Kruskal-Wallis-Rangsummentest und ein Wilcoxon-Rangsummentest durchgeführt. Die Ergebnisse wurden in Boxplots zusammengefasst und die relativen Häufigkeiten wurden mit Phyloseq berechnet und in Balkendiagrammen visualisiert. Alle durchgeführten statistischen Tests wurden um Mehrfachtests korrigiert und Alpha < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle Grafiken und Abbildungen wurden in R Version 4.0.4, Microsoft Office Excel 2010, erstellt.

Der erste Teil der erhaltenen Suspension (siehe oben) wurde zur DNA-Extraktion verwendet, der zweite Teil diente der Isolierung kultivierbarer Bakterien. Um so viele Samenendophyten wie möglich zu kultivieren, wurden 100 µL der Samensuspension auf 1/869 rich82, Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) (Sigma-Aldrich), R2A (Sigma-Aldrich), 28491, Mehl- Hefeextrakt-Saccharose-Kasein-Hydrolysat-Agar (Mehl1) und Extrakt-Kasein-Hydrolysat-Agar (YECD)92. Neben dem unverdünnten Mazerat wurden Reihenverdünnungen von 10–1 bis 10–3 KBE ml1 hergestellt.

Nach der Beimpfung wurden die Petrischalen mit den verschiedenen Medien 7 Tage lang bei 30 °C inkubiert. Das Bakterienwachstum und die Vielfalt der Kolonien wurden sowohl für unverdünnte als auch für verdünnte Samensuspensionen bewertet. Für weitere Experimente wurden einzelne, morphologisch unterschiedliche Kolonien ausgewählt und gereinigt. Anschließend wurden sie (in dreifacher Ausfertigung) in 96-Well-Masterblöcken bei 30 °C 7 Tage lang unter Schütteln mit 150 U/min gezüchtet. Ein Block wurde für die DNA-Extraktion verwendet, der zweite für PGP-Assays und der dritte wurde bei –45 °C in 15 % Glycerinlösung (75 g Glycerin, 4,25 g NaCl, 425 ml dH2O) gelagert.

Die DNA-Isolierung wurde unter Verwendung des Standardverfahrens zur DNA-Isolierung aus Bakterienpellets mit MagMAX Express 96 (APPLIED BIOSYSTEMS, Finnland) durchgeführt. Die DNA wurde in einem Qubit® 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific, USA) quantifiziert und zur Überprüfung der Reinheit wurde ein Nanodrop-Spektrophotometer (Thermo Scientific, USA) mit einem A260/A280-Verhältnis von 1,7–2,0 verwendet. Die nahezu vollständigen Sequenzen des 16S-rRNA-Gens wurden unter Verwendung der Primer 27f (5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3) und 1492r (5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3) amplifiziert. Ein Reaktionsvolumen von 25 μl pro Probe enthielt 1 μl DNA, 1 × Q5-Reaktionspuffer (2 mM MgCl2), 0,25 μM 27f- und 1492r-Primer, 200 μM dNTP-Mix und 0,02 U μl-1 Q5 High-Fidelity-DNA-Polymerase und 1 × 5 × Q5 High GC Enhancer84. Für einige DNA-Proben wurde eine 1/10- und 1/20-Verdünnung durchgeführt. Die PCR-Bedingungen waren die gleichen wie oben beschrieben, jedoch wurde die Anzahl der Zyklen auf 30 und die Annealing-Temperatur auf 55 °C reduziert. Die Proben für die 16S-rRNA-Sanger-Sequenzierung wurden an Macrogen (https://www.macrogen-europe.com/) versandt. Die Sequenzen wurden mit Geneious v4.8 qualitätsgefiltert und mit der Ribosomendatenbank SILVA (https://www.arb-silva.de/aligner/) analysiert. Bakterien wurden anhand der PCR-Amplifikation partieller 16S-rDNA-Gensequenzen identifiziert und mithilfe der NCBI-GenBank-Datenbanken durch das Programm Standard Nucleotide BLAST und RDP-Datenbank (https://rdp.cme.msu.edu/seqmatch/seqmatch_intro.jsp) annotiert.

Unter Berücksichtigung der Wachstumsbedingungen von C. phelypaea wurden die endophytischen Bakterienisolate auf ihre in vitro pflanzenwachstumsfördernden Eigenschaften und Salztoleranz bei hohen Salzkonzentrationen (6,5 %) getestet. Alle Tests wurden mindestens zweimal durchgeführt.

Die Tryptophanase-Aktivität und die Fähigkeit zur Produktion von Indol-3-Essigsäure (IAA) wurden mit dem Salkowski-Reagenz32 getestet. Die Produktion organischer Säure wurde mit der Methode von Cunningham und Kuiack93 bestimmt. Die ACC-Deaminase-Aktivität wurde in SMN-Medium mit 5 mM ACC94 getestet. Die Produktion von Siderophoren wurde unter Verwendung des 284-Mediums mit einer optimalen Eisenkonzentration von 0,25 μl mit CAS-Lösung95 bewertet. Die detaillierten Beschreibungen der Methoden wurden bereits zuvor vorgestellt32.

Die Salztoleranzfähigkeit isolierter Bakterien wurde unter Verwendung der modifizierten Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI)63 mit der Zusammensetzung getestet: Magenverdauung von tierischem Gewebe 10 g; Herzinfusion 10 g; Glukose 1 g; Natriumchlorid 65 g; Bromkresolviolett 0,016 g pro Liter mit pH 7,2. Die Bakterien wurden 5–7 Tage lang bei 30 °C und Rühren mit 150 U/min inkubiert. Nach 7 Tagen Reaktionszeit wurden die Proben auf sichtbares Wachstum (Trübung) oder Farbveränderung untersucht. Das Bakterienwachstum (Zunahme der Trübung) und/oder die Änderung der Farbe der Brühe von violett nach gelb wurde als positiv gewertet. Als Negativkontrolle wurde BHI ohne Bakterien gewählt.

Ribosomale RNA-Gensequenzen aus Bakterienisolaten wurden mit Referenzsequenzen aus den GenBank-Datenbanken unter Verwendung der BLAST-Software (Basic Local Alignment Search Tool) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) und der Ribosomal Database verglichen Die Website des Projekts (RDP) (http://rdp.cme.msu.edu/) und die Isolate wurden einer Art oder dem höchstmöglichen taxonomischen Rang zugeordnet.

Die Sequenzdaten sind im Sequence Read Archive der NCBI Genbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) mit der BioSample-Zugangsnummer SAMN26931786 verfügbar. Die von allen untersuchten Stämmen erhaltenen partiellen 16S-rRNA-Gensequenzen wurden in der GenBank-Datenbank unter den in der Ergänzungstabelle S1 angegebenen Zugangsnummern hinterlegt.

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Das Papier wurde im Rahmen der „Partnerschaftsvereinbarung zur Regelung der gemeinsamen Betreuung und Verleihung eines Doktortitels zwischen der Jan-Kochanowski-Universität in Kielce (Polen) und der Universität Hasselt (Belgien)“ (KP) erstellt.

Der Autor dankt für die finanzielle Unterstützung durch das Projekt „Development Accelerator of the Jan Kochanowski University of Kielce“, kofinanziert von der Europäischen Union im Rahmen des Europäischen Sozialfonds, mit der Nr. POWR.03.05.00-00-Z212/18 (KP) . Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Jan Kochanowski-Universität (WK; KP, SUPB.RN.23.236, 2023–2024) unterstützt. Diese Studie wurde auch durch ein BOF BILA-Stipendium der Hasselt University Belgium BOF21BL12 (2021–2022) (KP/JV) und das Methusalem-Projekt der Hasselt University (JV, 08M03VGRJ) unterstützt.

Abteilung für Mikrobiologie, Institut für Biologie, Jan-Kochanowski-Universität, Uniwersytecka 7, 25-406, Kielce, Polen

Kristine Petrosyan & Wiesław Kaca

Forschungsgruppe Umweltbiologie, Zentrum für Umweltwissenschaften, Universität Hasselt, Agoralaan Building D, 3590, Diepenbeek, Belgien

Kristine Petrosyan, Sofie Thijs und Jaco Vangronsveld

Abteilung für Umweltbiologie, Zentrum für Forschung und Erhaltung der Biodiversität, Institut für Biologie, Jan-Kochanowski-Universität, Uniwersytecka 7, 25-406, Kielce, Polen

Renata Piwowarczyk & Karolina Ruraż

Abteilung für Pflanzenphysiologie und Biophysik, Fakultät für Biologie und Biotechnologie, Institut für Biowissenschaften, Maria-Curie-Skłodowska-Universität, Akademicka, 19, 20-033, Lublin, Polen

Jaco Vangronsveld

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KP schrieb den Haupttext des Manuskripts, RP führte die Feldforschung durch und übernahm die formale Identifizierung des Pflanzenmaterials, JV und ST stellten die Methodik und Laborressourcen bereit; KP-Forschung, ST NGS-Datenkuration und Bioinformatik; RP, WK und JV schreiben, überprüfen und redigieren, KR technische Prüfung, RP, JV, WK und KP-Ressourcen; Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Kristine Petrosyan.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Petrosyan, K., Thijs, S., Piwowarczyk, R. et al. Diversität und potenzielle pflanzenwachstumsfördernde Fähigkeit samenendophytischer Bakterien des Holoparasiten Cistanche phelypaea (Orobanchaceae). Sci Rep 13, 11835 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38899-9

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Eingegangen: 02. Februar 2023

Angenommen: 17. Juli 2023

Veröffentlicht: 22. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38899-9

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