Design und Validierung von Dolosigranulum pigrum-spezifischen PCR-Primern unter Verwendung des bakteriellen Kerngenoms

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 6110 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Dolosigranulum pigrum – ein Milchsäurebakterium, das zunehmend als wichtiges Mitglied des nasalen Mikrobioms anerkannt wird. Derzeit gibt es nur begrenzte schnelle und kostengünstige Möglichkeiten zur Bestätigung von D. pigrum-Isolaten und zum Nachweis von D. pigrum in klinischen Proben. Hier beschreiben wir das Design und die Validierung eines neuartigen PCR-Assays für D. pigrum, der sowohl empfindlich als auch spezifisch ist. Wir haben einen PCR-Assay entwickelt, der auf murJ abzielt, ein Einzelkopie-Kernspezies-Gen, das durch die Analyse von 21 gesamten Genomsequenzen von D. pigrum identifiziert wurde. Der Assay erreichte eine Sensitivität von 100 % und eine Spezifität von 100 % gegen D. pigrum und verschiedene Bakterienisolate sowie eine Gesamtsensitivität von 91,1 % und eine Spezifität von 100 % unter Verwendung von Nasenabstrichen, wobei D. pigrum bei einem Schwellenwert von 1,0 × 104 Kopien des 16S-rRNA-Gens von D. pigrum nachgewiesen wurde pro Tupfer. Dieser Assay ergänzt das Mikrobiom-Forscher-Toolkit, das die Rolle von Generalisten- und Spezialbakterien in der Nasenumgebung untersucht, um ein zuverlässiges und schnelles D. pigrum-Nachweistool.

Dolosigranulum pigrum ist ein grampositives, nicht sporenbildendes Bakterium aus der Familie der Carnobacteriaceae1, das häufig in der menschlichen Nasenhöhle vorkommt2,3. D. pigrum wurde 1993 erstmals als kleine, weiße Kolonien beschrieben, die Beta-Hämolyse zeigten1. D. pigrum ist nach wie vor wenig erforscht und die einzige bisher bekannte Art von Dolosigranulum. Epidemiologisch wurde D. pigrum mit dem gesunden Zustand des Nasenmikrobioms in Verbindung gebracht3,4. Insbesondere ist die Besiedlung der oberen Atemwege durch D. pigrum negativ mit der Übertragung von Staphylococcus aureus verbunden5,6,7,8,9. Kürzlich wurde festgestellt, dass D. pigrum im Nasopharynx von Patienten mit asymptomatischen SARS-CoV-2-Infektionen häufiger vorkommt als von Patienten mit schwereren Symptomen10.

Zur Erleichterung zukünftiger klinischer und In-vitro-Studien sind schnelle und kostengünstige Methoden zur Identifizierung von D. pigrum erforderlich. Biochemische Standardmethoden sind teuer und zeitaufwändig, ebenso wie sequenzierungsbasierte Methoden. Die Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Flugzeitanalyse (MALDI-TOF) ist kostengünstig, kann jedoch nicht zum direkten Nachweis von D. pigrum aus klinischen Proben verwendet werden. Unter Verwendung eines Kerngenom-basierten Ansatzes haben wir einen PCR-basierten Assay entwickelt und validiert, der zur Bestätigung von D. pigrum-Isolaten und zum direkten Nachweis des Vorhandenseins von D. pigrum aus klinischen Proben verwendet werden kann.

Wir analysierten zunächst die genetische Vielfalt von 21 verfügbaren Gesamtgenomsequenzen von D. pigrum (n = 7 von NCBI und n = 14 von internen D. pigrum-Genomen, Tabelle S1). Wir extrahierten 87.993 SNPs aus nicht rekombinierten Regionen des Kerngenoms und untersuchten die genetische Vielfalt basierend auf der Maximum-Likelihood-Phylogenie (Abbildung S1). Dies zeigte mehrere unterschiedliche D. pigrum-Abstammungslinien, was sowohl auf die nichtklonale Natur von D. pigrum als auch auf die Robustheit der Genomsammlung hinweist. Anschließend generierten und analysierten wir das Pangenom von D. pigrum, um 1291 Kern- und 357 akzessorische Gene zu identifizieren. Als potenzielle Testziele haben wir uns auf die 1291-Kerngene konzentriert.

Die Entdeckung von Assay-Zielgenen war ein mehrstufiger Prozess (Abb. 1). Wir haben ribosomale Gene (n = 71) und Gene mit Homologen in anderen Gattungen (n = 345) entfernt. Es wurde eine manuelle Filterung zufällig ausgewählter Assay-Zielgene aus den 843 Einzelkopie-Kernspezies-Genen durchgeführt, wobei das Assay-Zielgen: (a) in allen 21 D. pigrum-Genomen vorhanden sein muss, (b) weniger als 70 haben muss % Ähnlichkeitsidentität und Abdeckung gegenüber Sequenzen von Nicht-Dolosigranulum-Taxa durch BLAST, (c) Vorwärts- und Rückwärtsprimersequenzen enthalten, die die Designkriterien von Primer3 erfüllen und die weniger als 50 % Ähnlichkeitsidentität und Abdeckung gegenüber Sequenzen von Nicht-Dolosigranulum-Taxa durch BLAST aufweisen.

Kerngenombasierter Ansatz für das Assay-Design. Schematische Darstellung des Ansatzes zum Durchsuchen des Pangenoms nach Testzielen. Jeder nachfolgende Schritt im Arbeitsablauf der Pangenomanalyse veranschaulicht, wie Gene gefiltert wurden, um schließlich ein einzigartiges Kerngenom für den interessierenden Organismus zu erhalten.

Das erste Single-Copy-Core-Spezies-Gen (SCSG), das unsere Auswahlkriterien als Zielgenkandidat mit konservierten Regionen für das Primer-Design erfüllte, war murJ (Pfam-ID: PF01943), ein Gen mit einer Länge von 1665 bp, das für eine Peptidoglycan-Lipid-II-Flipase kodiert Eiweiß. Der durchschnittliche unkorrigierte Abstand zwischen den Isolaten für das murJ-Alignment betrug 35,84 bp (SD = 13,67 bp) (Abb. 2a). Nach Iterationen des Primerdesigns und der In-silico-Analyse identifizierten wir ein Paar Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer (Tabelle 1, Ergänzungstabelle S4a–d), die auf das murJ-Gen abzielen, das ein 223-bp-PCR-Produkt produziert. Im Durchschnitt variierte das Amplikon zwischen den Isolaten um 2,14 bp (SD = 1,69 bp) (Abb. 2b, Ergänzungstabelle S3a, b, Ergänzungsdatei S1).

Dolosigranulum pigrum murJ Phylogenie und Sequenzausrichtung. (a) Nachbarverbindungsbaum, der unter Verwendung von murJ-Gensequenzen voller Länge aus 21 D. pigrum-Isolaten unter Verwendung von Jalview 2.11 37 erstellt und nach Zweiglängen geordnet wurde, was hervorhebt, dass murJ Teil des konservierten Kerngenoms ist, aber auch phylogenetisch informativ ist; (b) Mehrfachsequenz-Alignment der murJ-Amplikonregion, wobei sich der Vorwärtsprimer bei 1234–1255 bp und der Rückwärtsprimer bei 1436–1457 bp befindet.

Der murJ-Assay erwies sich bei der Laboranalyse von DNA aus Bakterienisolaten und aus menschlichen Nasenabstrichen als äußerst empfindlich und spezifisch. Wir haben den Assay zunächst anhand gut charakterisierter D. pigrum-Isolate (N = 12) und gegen fünf häufig vorkommende Nasenbakterienarten ausgewertet, nämlich Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium propinquum und Corynebacterium accolens, die eine Empfindlichkeit von 100 % zeigten Spezifität (Abbildung S3).

Wir haben den Assay weiter anhand von DNA ausgewertet, die aus menschlichen Nasenabstrichen (n = 110) extrahiert und mittels 16S-rRNA-V3–V4-Gensequenzierung charakterisiert wurde, darunter 54 Proben, die positiv für D. pigrum waren, und 56 Proben, die negativ für D. pigrum waren. Dies zeigte, dass der murJ-Assay D. pigrum in Proben (n = 9) mit weniger als zehn Kopien des 16S-rRNA-Gens von D. pigrum pro µL Abstricheluent oder 1,0 × 104 Kopien des 16S-rRNA-Gens von D. pigrum pro µL nicht nachweisen konnte Tupfer. Unter den 45 D. pigrum-positiven Proben mit mehr als 1,0 × 104 Kopien des 16S-rRNA-Gens von D. pigrum pro Abstrich konnte der murJ-PCR-Assay jedoch D. pigrum in 41 (91 %) Proben nachweisen (Tabelle 2, Abb . S4, S5). In den 56 D. pigrum-negativen Proben gab es keine falsch positiven Ergebnisse.

Durch die Identifizierung potenzieller Testziele mithilfe des Kerngenoms von D. pigrum haben wir einen neuartigen PCR-Test entwickelt, der sowohl empfindlich als auch spezifisch für D. pigrum ist. Im Gegensatz zu anderen häufig verwendeten Methoden zur Artenbestätigung, wie etwa biochemischen Tests, DNA-Sequenzierung oder MALDI-TOF, sind PCR-basierte Tests schnell und kostengünstig und erfordern keine teure Ausrüstung. Diese Methode bietet eine einfachere Option für den Nachweis von D. pigrum und vermeidet die Herausforderungen der Restriktionsverdauung und -analyse von T-RFLP11, das zuvor zum Nachweis mikrobieller Gemeinschaften in vorderen Nasenlöchern verwendet wurde12. Wir haben den Nutzen der Kerntechniken des Genom-Mining für die Entwicklung von Assays zur Artenbestätigung demonstriert. Der resultierende murJ-Assay konnte D. pigrum und verschiedene Bakterienisolate mit einer Sensitivität und Spezifität von 100 % identifizieren. Unser Assay war außerdem äußerst empfindlich und spezifisch für den Nachweis von D. pigrum in klinischen Proben.

Dolosigranulum pigrum gewinnt als Mitglied der mikrobiellen Gemeinschaft der oberen Atemwege, das potenziell von Vorteil für den Wirt ist, zunehmend an Interesse5,6,8,13,14,15,16,17,18,19. Es werden Anstrengungen unternommen, seine Stoffwechselmodelle und Abwehrmechanismen besser zu verstehen20. Es besteht ein dringender Bedarf, Proben zu untersuchen, um das Vorhandensein von D. pigrum nachzuweisen oder die Identität des durch kulturbasierte Methoden isolierten Organismus zu überprüfen. Unsere einstufige gelbasierte PCR-Methode zur Speziesüberprüfung von D. pigrum in klinischen Proben sowie reinen Isolaten bietet ein nützliches Werkzeug für epidemiologische und klinische Studien.

Wir haben eine lokale D. pigrum-Genomdatenbank kuratiert, indem wir öffentlich verfügbare Genome von NCBI RefSeq heruntergeladen und intern sequenzierte und zusammengesetzte D. pigrum-Genome hinzugefügt haben (Tabelle S1). DNA aus den hauseigenen D. pigrum-Isolaten wurde mit einem DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) oder einem MagNA Pure LC DNA Isolation Kit (Roche) extrahiert und Bibliotheken wurden mit einem Nextera XT DNA Library Kit (Illumina) gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Paarung erstellt -Endsequenzierung auf einem Illumina NextSeq 500 (Illumina, Inc., San Diego, CA) mit einer Leselänge von 150 bp. Wir haben kurze Illumina-Lesesequenzen aus hauseigenen D. pigrum-Isolaten mit dem SPADES-Assembler (v.3.5)21 zu Contigs zusammengestellt. Die Qualität der Zusammenstellung wurde anhand von Metriken bewertet, die von QUAST (v.2.3)22 generiert wurden, und alle Genome wurden mit Prokka (v.1.13)23 annotiert. Um die Empfindlichkeit des Assays für den Nachweis von D. pigrum zu maximieren, haben wir uns auf das Kerngenom konzentriert. Die GFF-Dateien aus dem Prokka-Annotationsschritt wurden als Eingabe für die Pan-Genom-Analyse mit Roary (v.3.12.0)24 verwendet [blastp v.2.9.0 Identität = 90 %, Genpräsenz in Isolaten, um Kern zu sein = 99 % ]. Wir haben einen Maximum-Likelihood-Baum aus Kerngenom-SNPs erstellt, um die Verwandtschaft der D. pigrum-Isolate mithilfe zuvor beschriebener Methoden zu bewerten 25, 26. Kurz gesagt, Illumina-Kurzablesungen von firmeninternen D. pigrum-Isolaten wurden mithilfe der NASP-Pipeline, die BWA-MEM verwendet (v. 0.7.12)27 zum Ausrichten und GATK (v.3.5)28 zum Aufrufen von SNPs. Öffentlich verfügbare Genome, die von NCBI RefSeq heruntergeladen wurden, wurden mithilfe von MUMMER mit der Referenz abgeglichen und SNPs identifiziert. Die resultierende SNP-Matrix wurde mit Gubbins29 verarbeitet, um rekombinante Regionen zu entfernen. Ein phylogenetischer Baum wurde aus den Kern-SNPs in PhyML mit Smart Model Selection (v.3.0)30 erstellt. Die Maximum-Likelihood-Phylogenie wurde zusammen mit dem Pangenom mithilfe von PHANDANGO31 visualisiert (Abbildung S2). Uniprot-IDs der Kerngene wurden, sofern verfügbar, mithilfe eines internen Skripts aus den GFF-Dateien extrahiert und zum Abrufen von Begriffen der Genontologie aus der UniProt-Datenbank32 (Tabelle S2) verwendet. Die GO-Begriffe wurden mit GAOTools33 analysiert und zusammengefasst.

Das Kerngenom wurde gefiltert und nur SCSG blieb erhalten. Eine In-silico-Suche nach Homologie gegen Nicht-D. Pigrum-Arten wurden mit Blastn v.2.9.034 unter Verwendung einer lokalen Kopie der NT-Datenbank durchgeführt (aktualisiert: 31.03.2019). Genziele mit 70 % Ähnlichkeit mit Nicht-D. Pigrum-Arten wurden entfernt. Ein endgültiger Satz homologer Einzelkopie-Kerngene wurde als Kandidatenpool für Ziele zur Entwicklung eines D. pigrum-spezifischen Tests verwendet.

Wir haben Primer335 mit Standardeinstellungen verwendet, um mögliche Vorwärts- und Rückwärtsprimer zu identifizieren, die zunächst mit der Gen-Alignment-Datei von D. pigrum verglichen und dann auf Ähnlichkeit mit anderen Nasenbakterien überprüft wurden, darunter Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium spp., Cutibacterium spp., Moraxella spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Proteus spp. und Alloiococcus spp. Primer wurden ausgeschlossen, wenn am 3'-Ende des Primers 5 oder mehr passende Basen gefunden wurden.

Um die Empfindlichkeit unserer Primer zu beurteilen, haben wir den murJ-Assay gegen 12 D. pigrum-Isolate getestet. Bei diesen Isolaten wurde zuvor durch MALDI-TOF bestätigt, dass es sich um D. pigrum handelt, und ihre Genome wurden mit dem Illumina HiSeq-System (Illumina, San Diego, CA) sequenziert. Darüber hinaus haben wir murJ-Primer gegen 110 klinische Proben gescreent, die wie zuvor beschrieben durch eine 16S-rRNA-Gen-basierte Sequenzierung gekennzeichnet waren36. Ein Nicht-D. Die Pigrum-Kontrollsammlung, die Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium propinquum und Corynebacterium accolens-Arten umfasste, wurde zur Bewertung der Spezifität unserer Primer verwendet.

Die ethische Genehmigung für diese Studie wurde vom Institutional Review Board der George Washington University und dem Office of Human Research erteilt. Die Studie und ihre Protokolle wurden gemäß den genehmigten Richtlinien durchgeführt, die in der Deklaration von Helsinki dargelegt sind. Vor der Aufnahme in die Studie wurde von allen Teilnehmern eine Einverständniserklärung eingeholt.

Die erste Studie umfasste 16 gesunde, in Wohngemeinschaften lebende Erwachsene in Washington, DC (IRB-Nr.: NCR191444). Bei der Einschreibung wurden Nasenproben von den Teilnehmern unter Anleitung des Personals unter Verwendung von Puritan HydraFlock-Tupfern (Puritan Medical Products, Guilford, ME) und unter Anweisung des Personals selbst entnommen. Die Proben wurden sofort in Amies-Transportmedien gegeben und bis zur Verarbeitung bei 4 °C gelagert. Die Proben wurden innerhalb von 4 Stunden verarbeitet und dann in 100-μL-Aliquoten in beschriftete 2-ml-Kryoröhrchen überführt und bei –80 °C gelagert. Die zweite Studie umfasste 94 gesunde, in einer Wohngemeinschaft lebende Erwachsene in Kopenhagen, Dänemark (IRB # 041631), die vom Studienpersonal gesammelt und in einem DNA/RNA-Schutz (Zymo R1100-250) gesammelt und bis zur Verarbeitung bei –80 °C gelagert wurden.

DNA aus menschlichen Nasenabstrichen wurde mit dem MagMax DNA Ultra 2.0 Kit mit Enzym und chemischer Lyse wie zuvor beschrieben extrahiert 5. DNA aus Bakterienisolaten wurde durch Hitzeeinweichen (D. pigrum, S. aureus und S. epidermidis) oder mit DNeasy extrahiert Blut- und Gewebekit (Qiagen, Valencia, CA) (C. propinquum und C. pseudodiphtheriticum) gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Jede murJ-PCR wurde in einem Reaktionsvolumen von 20 μl durchgeführt, das 1 μl Matrizen-DNA enthielt und zu 19 μl PCR-Reaktionsgemisch mit 0,4 μM Vorwärts- (5′-CAACAGCGTCCAGCAATCTA-3′) und Rückwärts- (5′-ATCGCTGTAATCCCGATGAG-3′) enthielt. Primer, 1× Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (ThermoFisher) und Wasser in Molekularqualität. Die Amplifikation wurde auf einem C1000 Touch Thermocycler (Bio-Rad, Hercules, CA) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 98 °C für 30 s zum Denaturieren, 54 °C für 30 s zum Annealing und 72 °C für 1 Minute für die Verlängerung × 35 Zyklen. Die amplifizierte DNA wurde auf einem 2 %igen Agarose-E-Gel (ThermoFisher) laufen gelassen, um die Amplifikation der D. pigrum-DNA zu beurteilen. Gele wurden mit einem ChemiDoc-It2 (Analytik Jena US, Upland, CA) abgebildet. Das Vorhandensein einer sichtbaren Bande bei der Größe von 223 bp zeigte eine erfolgreiche Amplifikation an.

Rohdaten, die aus der für diese Studie durchgeführten Sequenzierung des gesamten Genoms generiert wurden, wurden bei NCBI SRA hinterlegt (Zugangs-ID: PRJNA770953).

Aguirre, M., Morrison, D., Cookson, BD, Gay, FW & Collins, MD Phänotypische und phylogenetische Charakterisierung einiger Gemella-ähnlicher Organismen aus menschlichen Infektionen: Beschreibung von Dolosigranulum pigrum gen. Nov., sp. nov.. J. Appl. Bakteriol. 75, 608–612 (1993).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Toivonen, L. et al. Frühe nasale Mikrobiota und akute Atemwegsinfektionen in den ersten Lebensjahren. Thorax 74, 592–599 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Kaspar, U. et al. Das Kulturom der menschlichen Nasenlebensräume zeigt individuelle bakterielle Fingerabdruckmuster. Umgebung. Mikrobiol. 18, 2130–2142 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gan, W. et al. Der Unterschied in der Diversität des bakteriellen Mikrobioms der Nase zwischen Patienten mit chronischer Rhinosinusitis mit Polypen und einer Kontrollpopulation. Int. Forum Allergie Rhinol. 9, 582–592 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Liu, CM et al. Staphylococcus aureus und die Ökologie des nasalen Mikrobioms. Wissenschaft. Adv. 1, e1400216 (2015).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Accorsi, EK et al. Determinanten des Transports von Staphylococcus aureus im sich entwickelnden Nasenmikrobiom des Säuglings. Genombiol. 21, 301 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Biesbroek, G. et al. Die Auswirkungen des Stillens auf die mikrobiellen Gemeinschaften im Nasopharynx bei Säuglingen. Bin. J. Atmung. Krit. Pflege Med. 190, 298–308 (2014).

Artikel PubMed Google Scholar

Biesbroek, G. et al. Die frühe respiratorische Mikrobiota-Zusammensetzung bestimmt bakterielle Sukzessionsmuster und die Gesundheit der Atemwege bei Kindern. Bin. J. Atmung. Krit. Pflege Med. 190, 1283–1292 (2014).

Artikel PubMed Google Scholar

Teo, SM et al. Das nasopharyngeale Mikrobiom des Säuglings beeinflusst die Schwere der Infektion der unteren Atemwege und das Risiko der Asthmaentwicklung. Cell Host Microbe 17, 704–715 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hurst, JH et al. Altersbedingte Veränderungen im nasopharyngealen Mikrobiom sind mit einer schweren Infektion und Symptomen des akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) bei Kindern, Jugendlichen und jungen Erwachsenen verbunden. Klin. Infizieren. Dis. 75, e928–e937 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Prakash, O., Pandey, PK, Kulkarni, GJ, Mahale, KN & Shouche, YS Technische Details und Störungen des terminalen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (T-RFLP). Indian J. Microbiol. 54, 255–261 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Camarinha-Silva, A., Wos-Oxley, ML, Jauregui, R., Becker, K. & Pieper, DH Validierung von T-RFLP als empfindlicher Hochdurchsatzansatz zur Beurteilung bakterieller Diversitätsmuster in menschlichen vorderen Nasenlöchern. FEMS Mikrobiol. Ökologisch. 79, 98–108 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Raya Tonetti, F. et al. Das respiratorische Kommensalbakterium Dolosigranulum lagrum 040417 verbessert die angeborene Immunantwort auf Streptococcus pneumoniae. Mikroorganismen 9, 25 (2021).

Google Scholar

De Boeck, I. et al. Die Diversität der vorderen Nasenhöhlen und Pathobionten repräsentieren das Sinusmikrobiom bei chronischer Rhinosinusitis. mSphere 4, 25 (2019).

Artikel Google Scholar

Coleman, A. et al. Mikrobiota der oberen Atemwege im Zusammenhang mit der Gesundheit von Ohren und Nase bei Kindern australischer Ureinwohner und Inselbewohner der Torres-Straße. J. Pädiatr. Infizieren. Dis. Soc. 10, 468–476 (2021).

Artikel Google Scholar

Hurst, JH et al. Altersbedingte Veränderungen im Mikrobiom der oberen Atemwege sind mit der Anfälligkeit für SARS-CoV-2 und der Schwere der Erkrankung verbunden. medRxiv 20, 25 (2021).

Google Scholar

Laufer, AS et al. Mikrobielle Gemeinschaften der oberen Atemwege und der Mittelohrentzündung bei Kindern. MBio 2, e00245-e1210 (2011).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ortiz Moyano, R. et al. Die Fähigkeit von respiratorischen Kommensalbakterien, die angeborene Immunantwort der Lunge positiv zu modulieren, ist ein stammabhängiges Merkmal. Mikroorganismen 8, 25 (2020).

Artikel Google Scholar

Bosch, A. et al. Reifung der respiratorischen Mikrobiota des Säuglings, Umweltfaktoren und gesundheitliche Folgen. Eine prospektive Kohortenstudie. Bin. J. Atmung. Krit. Pflege Med. 196, 1582–1590 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Flores Ramos, S. et al. Genomische Stabilität und genetische Abwehrsysteme in Dolosigranulum pigrum, einem möglichen nützlichen Bakterium aus dem menschlichen Mikrobiom. MSystems 20, e0042521 (2021).

Artikel Google Scholar

Nurk, S. et al. Zusammenbau von Einzelzellgenomen und Minimetagenomen aus chimären MDA-Produkten. J. Comput. Biol. 20, 714–737 (2013).

Artikel MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gurevich, A., Saveliev, V., Vyahhi, N. & Tesler, G. QUAST: Qualitätsbewertungstool für Genomassemblierungen. Bioinformatik 29, 1072–1075 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Seemann, T. Prokka: Schnelle Annotation des prokaryotischen Genoms. Bioinformatik 30, 2068–2069 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Page, AJ et al. Roary: Schnelle groß angelegte Prokaryoten-Pan-Genomanalyse. Bioinformatik 31, 3691–3693 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Price, LB et al. Staphylococcus aureus CC398: Wirtsanpassung und Entstehung einer Methicillinresistenz bei Nutztieren. MBio 3, 15 (2012).

Artikel Google Scholar

Reid, CJ, McKinnon, J. & Djordjevic, SP Klonale ST131-H22-Escherichia-coli-Stämme eines gesunden Schweins und einer menschlichen Harnwegsinfektion tragen sehr ähnliche Resistenz- und Virulenzplasmide. Mikrob. Genom 5, 25 (2019).

Google Scholar

Li, H. & Durbin, R. Schnelle und genaue Ausrichtung kurzer Lesevorgänge mit der Burrows-Wheeler-Transformation. Bioinformatik 25, 1754–1760 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McKenna, A. et al. Das Genome Analysis Toolkit: Ein MapReduce-Framework zur Analyse von DNA-Sequenzierungsdaten der nächsten Generation. Genomres. 20, 1297–1303 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Croucher, NJ et al. Schnelle phylogenetische Analyse großer Proben rekombinanter bakterieller Gesamtgenomsequenzen mithilfe von Gubbins. Nukleinsäuren Res. 43, e15 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Guindon, S. et al. Neue Algorithmen und Methoden zur Schätzung der Maximum-Likelihood-Phylogenien: Bewertung der Leistung von PhyML 3.0. Syst. Biol. 59, 307–321 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hadfield, J. et al. Phadango: Ein interaktiver Viewer für die Genomik von Bakterienpopulationen. Bioinformatik 34, 292–293 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

UniProt, C. UniProt: Die universelle Protein-Wissensdatenbank im Jahr 2021. Nucleic Acids Res. 49, D480–D489 (2021).

Artikel Google Scholar

Klopfenstein, DV et al. GOATOOLS: Eine Python-Bibliothek für Gen-Ontologie-Analysen. Wissenschaft. Rep. 8, 10872 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Camacho, C. et al. BLAST+: Architektur und Anwendungen. BMC Bioinform. 10, 421 (2009).

Artikel Google Scholar

Untergasser, A. et al. Primer3 – neue Funktionen und Schnittstellen. Nukleinsäuren Res. 40, e115 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, CM et al. Die männliche Beschneidung reduziert die Prävalenz und Belastung genitaler anaerober Bakterien erheblich. MBio 4, e00076 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Waterhouse, AM, Procter, JB, Martin, DM, Clamp, M. & Barton, GJ Jalview Version 2 – ein Editor für die Ausrichtung mehrerer Sequenzen und eine Analyse-Workbench. Bioinformatik 25, 1189–1191 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien der National Institutes of Health (R01AI125562) an LBP und durch ein Ausbildungsstipendium der Milken Institute School of Public Health an AP unterstützt. Für den Inhalt dieser Veröffentlichung sind ausschließlich die Autoren verantwortlich und geben nicht unbedingt die offizielle Meinung der Fördergeber wieder.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Maliha Aziz und Amber Palmer.

Antibiotic Resistance Action Center, Department of Environmental and Occupational Health, Milken Institute School of Public Health, George Washington University, 800 22nd Street NW, Washington, DC, 20052, USA

Maliha Aziz, Amber Palmer, Juan E. Salazar, Tony Pham, Kelsey Roach, Lance B. Price und Cindy M. Liu

Abteilung für Bakterien, Parasiten und Pilze, Statens Serum Institut, Artillerivej 5, 2300, Kopenhagen, Dänemark

Søren Iversen, Sharmin Baig, Marc Stegger und Paal Skytt Andersen

Friedrich-Loeffler-Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Greifswald, Greifswald, Deutschland

Karsten Becker

Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsklinikum Münster, Münster, Deutschland

Ursula Kaspar

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MA und AP haben gleichermaßen zur Erstellung dieses Manuskripts beigetragen. CL hat die Studie konzipiert. MA führte Data Mining und bioinformatische Analysen durch. MA und AP analysierten die Ergebnisse. KB, UK, PA und MS stellten Studien- und Labormaterialien zur Verfügung. SI und SB generierten die Genomreferenz von D. pigrum. AP, KRTP und JS führten Assay-Validierungsexperimente durch. Alle Autoren haben zum Manuskript beigetragen und es überprüft.

Korrespondenz mit Cindy M. Liu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Aziz, M., Palmer, A., Iversen, S. et al. Design und Validierung von Dolosigranulum pigrum-spezifischen PCR-Primern unter Verwendung des bakteriellen Kerngenoms. Sci Rep 13, 6110 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32709-y

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Eingegangen: 15. Dezember 2022

Angenommen: 31. März 2023

Veröffentlicht: 14. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32709-y

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