Das Plasmametabolom von Long-COVID-Patienten zwei Jahre nach der Infektion

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12420 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine der größten Herausforderungen, vor denen die globalen Gesundheitssysteme derzeit stehen, ist das verlängerte COVID-19-Syndrom (auch bekannt als „Long COVID“), das als Folge der SARS-CoV-2-Epidemie aufgetreten ist. Es wird geschätzt, dass mindestens 30 % der Patienten, die an COVID-19 erkrankt sind, eine lange COVID-Erkrankung entwickeln. In dieser Studie bestand unser Ziel darin, das Plasma-Metabolom in insgesamt 100 Proben zu untersuchen, die von gesunden Kontrollpersonen, COVID-19-Patienten und Langzeit-COVID-Patienten, die zwischen 2020 und 2022 in Mexiko rekrutiert wurden, entnommen wurden. Ein gezielter Metabolomics-Ansatz unter Verwendung einer Kombination aus LC– MS/MS und FIA MS/MS wurden durchgeführt, um 108 Metaboliten zu quantifizieren. IL-17 und Leptin wurden bei Long-COVID-Patienten mittels immunoenzymatischem Assay gemessen. Der Vergleich gepaarter COVID-19-/Long-COVID-19-Proben ergab 53 Metaboliten, die statistisch unterschiedlich waren. Im Vergleich zu den Kontrollen blieben 27 Metaboliten auch nach zwei Jahren weiterhin fehlreguliert. Post-COVID-19-Patienten zeigten ein heterogenes Stoffwechselprofil. Milchsäure, Laktat/Pyruvat-Verhältnis, Ornithin/Citrullin-Verhältnis und Arginin wurden als die relevantesten Metaboliten zur Unterscheidung von Patienten mit komplizierterer langer COVID-Entwicklung identifiziert. Darüber hinaus waren die IL-17-Spiegel bei diesen Patienten signifikant erhöht. Mitochondriale Dysfunktion, ein Ungleichgewicht des Redox-Zustands, ein beeinträchtigter Energiestoffwechsel und eine chronische Dysregulation des Immunsystems dürften auch zwei Jahre nach einer akuten COVID-19-Infektion die Hauptmerkmale einer langen COVID-Erkrankung sein.

In der Vergangenheit wurden hochpathogene Beta-Coronaviren mit schweren Atemwegserkrankungen in Verbindung gebracht. Nach Angaben der WHO waren das schwere akute respiratorische Syndrom-Coronavirus (SARS-CoV) und das Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus (MERS-CoV) in den Jahren 2002–2003 bzw. 2015 für Epidemien verantwortlich. Während der SARS-CoV-Epidemie wurde das Virus in 29 Ländern mit 8.437 Fällen und 813 Todesfällen gemeldet1. Andererseits wurde MERS-CoV zwischen 2012 und 2020 in 27 Ländern mit 2.519 im Labor bestätigten Fällen gemeldet, was zu 866 Todesfällen führte2. Im Jahr 2019, genau 100 Jahre nach der letzten durch ein H1N1-Influenza-A-Virus (die Spanische Grippe) verursachten Pandemie, betraf eine neue Pandemie fast jedes Land der Welt. Bis zum 26. Februar 2023 wurden weltweit über 758 Millionen bestätigte Fälle von SARS-CoV-2 und über 6,8 Millionen Todesfälle gemeldet. Bis heute sind rund 653 Millionen Patienten genesen3. Allerdings begannen bereits im Frühjahr 2020 Menschen, ihre Erfahrungen mit der nicht vollständigen Genesung von einer SARS-CoV-2-Infektion zu schildern4. Diese erweiterte Version der Krankheit wird „Long COVID“ genannt. Interessanterweise ist der Begriff „Long COVID“ ein von Patienten geschaffener Begriff, der auf Twitter von Elsa Perego, einer Archäologin am University College London, beworben wird.

Es wurde vielfach beschrieben, dass einige Viren auch ein Jahrzehnt nach der Infektion zu anhaltenden physiologischen Veränderungen führen. Der Begriff „postvirales Syndrom“ wird seit über einem Jahrhundert verwendet5. Chronische Symptome wie Müdigkeit, Gelenkschmerzen und Herz-Kreislauf-Probleme wurden nach der Genesung von anderen Infektionen wie West-Nil, Polio, Dengue-Fieber, Zika, saisonaler Grippe, Epstein-Barr, Ebola, MERS und SARS berichtet6,7. Allerdings hat keines dieser Viren im gleichen Zeitfenster so viele Menschen befallen wie SARS-CoV-2, was der wissenschaftlichen Gemeinschaft eine einzigartige Gelegenheit bietet, die Ätiologie postviraler Syndrome wie Long-COVID zu verstehen.

Long-COVID (auch bekannt als Post-COVID-19-Syndrom oder postakute Folgen von COVID-19 (PACS)) ist eine Erkrankung, die durch langfristige oder anhaltende Gesundheitsprobleme gekennzeichnet ist, die nach der ersten Genesung von einer COVID-19-Infektion auftreten. Die WHO hat Long-COVID als einen Zustand beschrieben, „der bei Personen mit einer Vorgeschichte einer wahrscheinlichen oder bestätigten SARS-CoV-2-Infektion in der Regel drei Monate nach Ausbruch auftritt und die Symptome mindestens zwei Monate anhalten und nicht durch eine Alternative erklärt werden können.“ Diagnose“8. Es wird geschätzt, dass 30–60 % der genesenen Patienten auch nach einer leichten Erkrankung eine lange COVID-Erkrankung oder eine unterschiedlich lange anhaltende Symptomatik haben9. Basierend auf einer konservativen Schätzung der Inzidenz könnten mindestens 65 Millionen Menschen weltweit an Long-COVID-3 leiden.

Ähnlich wie COVID-19 betrifft Long-COVID mehrere Organsysteme, darunter das Atmungs-, Herz-Kreislauf-, Nerven- und Magen-Darm-System. Es wurden mehr als 50 Symptome im Zusammenhang mit Long-COVID10 gemeldet. Beobachtungsstudien haben gezeigt, dass einige symptomatische Zustände bei 50 % der Patienten innerhalb von drei Monaten nach dem Krankenhausaufenthalt abgeklungen sind11, die Rate der vollständigen Genesung sinkt jedoch zwischen drei und sechs Monaten nach dem Krankenhausaufenthalt auf 35 % und zwischen 6 und 9 Monaten auf 15 %. Wichtig ist, dass ein großer Teil dieser Bevölkerung eine Restschädigung des Lungengewebes mit erkennbaren radiologischen Anomalien in der Computertomographie (CT) des Brustkorbs aufweist12. Müdigkeit, Konzentrationsverlust, Kopfschmerzen, Kurzatmigkeit, Anosmie, Muskelschwäche und Gelenkschmerzen sind einige der am häufigsten berichteten Symptome. Long-COVID ist daher mehr als eine homogene Einheit und könnte als ein Spektrum von Erkrankungen betrachtet werden, das Personen mit direkt mit dem Virus verbundenen Komplikationen (langfristige Restschäden in der Lunge, im Gehirn oder im Herzen) sowie Personen mit systemischen Unspezifischen Symptomen betrifft Anzeichen/Symptome (Müdigkeit, Kopfschmerzen und Arthromyalgien)13. Die zunehmende Zahl von Patienten mit Long-COVID stellt eine Herausforderung für die öffentlichen Gesundheitssysteme auf der ganzen Welt dar. Derzeit gibt es jedoch keine Richtlinien für die genaue Diagnose von Patienten mit Long-COVID, und die Klassifizierung wird immer noch unterschätzt und ist subjektiv.

Sowohl die ungezielte als auch die gezielte Metabolomik haben sich als wertvolle Instrumente für die Untersuchung von Long-COVID erwiesen. Unsere Ergebnisse, die auf einem ungezielten Lipidomics-Ansatz basieren,14 zeigen, dass mehrere Arten von Phosphatidylcholinen und Sphingomyelinen bei Patienten mit langer COVID-19-Erkrankung im Vergleich zu Kontrollen in höheren Konzentrationen exprimiert wurden. Die gepaarte Analyse, die Patienten mit einer aktiven Infektion und zwei Jahre nach der Genesung vergleicht, zeigte 170 fehlregulierte Lipidmerkmale.

In der vorliegenden Arbeit verwendeten wir quantitative gezielte Metabolomik, um die metabolische Umkehrung von Patienten mit anhaltenden Folgen aufgrund einer bestätigten SARS-CoV-2-Infektion zu bewerten. Durch den Vergleich mit Negativkontrollen konnten wir diejenigen Metaboliten identifizieren, die nach zwei Jahren nach der Erstinfektion dauerhaft fehlreguliert waren. Anzahl, Art der Symptome sowie metabolische Signaturen waren bei Patienten mit langem COVID (von uns willkürlich als Patienten mit langem COVID der Klassen A und B definiert) und bei genesenen Patienten (nicht langes COVID) unterschiedlich. Darüber hinaus war der IL-17-Spiegel bei Patienten mit der schlimmsten Krankheitsentwicklung (Klasse-B-Patienten) erhöht. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste gezielte Metabolomics-Studie an Langzeit-COVID-Patienten, die über zwanzig Monate nach der Infektion hinaus durchgeführt wurde.

Tabelle 1 zeigt die Ausgangsmerkmale der in die Studie aufgenommenen Patienten. Das Alter unterschied sich statistisch gesehen zwischen negativen (gesunden) Kontrollpersonen und COVID-19-Patienten. Bei den selbstberichteten Komorbiditäten konnten jedoch keine Unterschiede festgestellt werden. Sechs Patienten (12,5 %) entwickelten eine leichte Erkrankung; 37 Patienten (77 %) entwickelten eine mittelschwere/schwere Erkrankung, während fünf Patienten (10,4 %) eine kritische Erkrankung entwickelten. Sechs Patienten (12,5 %) wurden in den Jahren 2021 und 2022 erneut infiziert. Alle Patienten wurden im Zeitraum 2021–2022 vollständig geimpft. Zusätzliche Informationen von Patienten mit Long-COVID der Klasse A, Long-COVID-Patienten der Klasse B und Genesenen (nicht Long-COVID) finden Sie in der Ergänzungstabelle 1.

Der von den Patienten beantwortete Fragebogen ergab die hartnäckigsten Symptome, die in fünf große Kategorien eingeteilt wurden: systemische, neurologische, psychiatrische, kardiologische und respiratorische Symptome. Die vorherrschenden Symptome waren Gedächtnisverlust (73,3 %), Schlafstörungen, Arthralgie, Müdigkeit, Belastungsunverträglichkeit, Myalgie (66,7 %) und Angstzustände (60,0 %) (Abb. 1). Bei Patienten der Klasse A traten hauptsächlich neuropsychiatrische Symptome mit einem gleichzeitigen Auftreten von fünf oder weniger Symptomen auf, während bei Patienten der Klasse B sowohl neuropsychiatrische als auch systemische Symptome mit einer Häufigkeit von mehr als fünf Begleitsymptomen auftraten (ergänzende Abbildung 1).

Die häufigsten Symptome blieben bei 48 Post-COVID-19-Patienten auch nach 24 Monaten bestehen. (a) Verteilung der Symptome nach Organsystemen. (b) Ergebnisse, die über einen persönlichen Fragebogen ermittelt wurden.

Beim metabolischen Vergleich gepaarter Proben (COVID-19/langes COVID-19) von 15 Patienten wurde festgestellt, dass sich 53 Plasmametaboliten signifikant unterschieden (FDR < 0,05). Das Vulkandiagramm (Abb. 2a) zeigt, dass 13 Metaboliten in der langen COVID-19-Phase signifikant hochreguliert waren, während 32 mit einem Fold Change (FC)-Schwellenwert von > 1,3 (FDR < 0,05) herunterreguliert wurden. Die Heatmap-Analyse (Abb. 2b) zeigt eine Häufung von Patienten entsprechend ihrer COVID-19- und langen COVID-Phase und zeigt, dass LysoPCs (außer LysoPC 18:2) und SMs in der langen COVID-Phase herunterreguliert wurden. Die multivariate Analyse (über PLS-DA) zeigte eine klare Trennung zwischen beiden COVID-Phasen (Genauigkeit: 0,97, R2: 0,94, Q2: 0,77) (Abb. 2c). Der VIP-Plot (Abb. 2d) zeigt, dass Phenylalanin, Taurin, Glutamin und Spermidin in der langen COVID-19-Phase niedrigere Plasmakonzentrationen aufwiesen, während das Glutamin/Glutamat-Verhältnis in der langen COVID-19-Phase erhöht war.

Multivariate Analyse. (a) Das Vulkandiagramm der Plasmametabolomik zwischen der COVID-19-Phase und der langen COVID-19-Phase. Faltungsschwellenwert = 1,3 und q-Wert = 0,05 (FDR angepasst). Rot hervorgehobene Metaboliten werden in der langen COVID-Phase überexprimiert. (b) Repräsentative Heatmap der 50 wichtigsten Metaboliten (t-Test) im Vergleich von COVID-19 und langen COVID-19-Phasen (rot (0): COVID-19-Phase; grün (1): lange COVID-19-Phase) . (c) Score-Streudiagramm basierend auf dem zweidimensionalen PLS-DA (rot (0): COVID-19-Phase; grün (1): lange COVID-19-Phase). (d) Rang der verschiedenen Metaboliten (die Top 15), die vom PLS-DA gemäß dem VIP-Score auf der x-Achse identifiziert wurden. Die aussagekräftigsten Metaboliten werden in absteigender Reihenfolge ihrer Koeffizientenwerte angezeigt. Die Farbfelder zeigen an, ob die Metabolitenkonzentration erhöht (rot) oder verringert (blau) ist.

Um zu wissen, ob die veränderten Metaboliten (und diejenigen, die unbedeutend blieben) im Vergleich zu Normalwerten fehlreguliert waren, wurde der Analyse eine Gruppe negativer SARS-CoV-2-Kontrollen (d. h. gesunde Kontrollen) aus dem Jahr 2020 hinzugefügt. Die Heatmap (Abb. 3a) zeigt die Metaboliten mit signifikanten Unterschieden zwischen den drei Studiengruppen (einfache ANOVA). Vulkandiagramme (Abb. 3b) wurden verwendet, um die fehlregulierten Metaboliten bei den Patienten mit langer COVID-19-Erkrankung im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen zu identifizieren. T-Tests bei zwei Stichproben und Wilcoxon-Rangsummentests zeigen, dass im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen bei Long-COVID-Patienten immer noch 27 Metaboliten fehlreguliert waren. C18:2 (angepasster p = 2,4 × 10–6), C10:2 (angepasster p = 3 × 10–3), C10:1 (angepasster p = 3 × 10–3) sowie Glutamin (angepasster p = 3,3 × 10–7), Cholin (angepasster p = 3 × 10–4), Glucose (angepasster p = 5 × 10–5), Kynurenin (angepasster p = 3 × 10–4), Brenztraubensäure (angepasster p = 1,0). × 10–2), Kynurenin/Tryptophan-Verhältnis (angepasster p = 2,0 × 10–02) und Putrescin (angepasster p = 0,01) wurden bei Patienten mit langer COVID-19-Erkrankung im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen in höheren Konzentrationen gefunden.

Multivariate Analyse. (a) Repräsentative durchschnittliche Heatmap der 50 wichtigsten Metaboliten (ANOVA) im Vergleich von Kontrollen, COVID-19- und Langzeit-COVID-19-Patienten. (b) Das Vulkandiagramm der Plasmametabolomik zwischen Kontrollpersonen und Patienten mit langer COVID-19-Erkrankung (rot stellt die hochregulierten Metaboliten im Vergleich zu den Kontrollen dar, blau stellt die herunterregulierten Metaboliten im Vergleich zu den Kontrollen dar und grau stellt die Metaboliten ohne Unterschied zwischen ihnen dar). beide Gruppen). Fold-Change-Schwellenwert = 1,3 und p-Wert = 0,05 (FDR angepasst). (c) Scoring-Streudiagramm basierend auf dem zweidimensionalen PLS-DA. (d) Rang der verschiedenen Metaboliten (die Top 15), die vom PLS-DA gemäß dem VIP-Score auf der x-Achse identifiziert wurden. Die aussagekräftigsten Metaboliten werden in absteigender Reihenfolge ihrer Koeffizientenwerte angezeigt. Die Farbfelder zeigen an, ob die Metabolitenkonzentration erhöht (rot) oder verringert (blau) ist.

Darüber hinaus lysoPC 14:0 (angepasster p = 2,8 × 10–3), lysoPC 16:0 (angepasster p = 8,9 × 10–9), lysoPC 16:1 (angepasster p = 1,7 × 10–3), lysoPC 18 :0 (angepasster p = 3,6 × 10–6), LysoPC 17:0 (angepasster p = 3,0 × 10–4), LysoPC 20:4 (angepasster p = 1,5 × 10–3), SM(OH)22:1 (angepasster p = 0,04), PC aa 32:2 (angepasster p = 0,03), Sarkosin (angepasster p = 5,4 × 10–4), Taurin (angepasster p = 1,3 × 10–3) und Glutaminsäure (angepasster p = 2,9 × 10–4) wurden bei Patienten mit langer COVID-19-Erkrankung im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen herunterreguliert festgestellt. Ebenso war das Glutamin/Glutamat-Verhältnis (bereinigter p = 3,3 × 10–7) bei Patienten mit langer COVID-19-Erkrankung erhöht, während das Laktat/Pyruvat-Verhältnis (bereinigter p = 2,9 × 10–4) erniedrigt war.

Glucose, C10:2, C18:1, C10:1, LysoPC 14:0, LysoPC 16:1, LysoPC 18:1, PC ae 36:0, Harnsäure, C10 und Brenztraubensäure lagen in ähnlichen Konzentrationen vor Niveaus wie für diejenigen in der COVID-19-Phase.

Mehrere andere Metaboliten, die zuvor mit der Schwere von COVID-19 in Zusammenhang gebracht wurden, neigen in der Gruppe mit langer COVID-19-Erkrankung zu normalen oder gesunden Werten (Kynurenin/Tryptophan-Verhältnis, C18:2, Glutaminsäure, Glutamin, Spermidin, Kynurenin). Bemerkenswert ist eine Gruppe von Sphingomyelinen (SM(OH)14:0, SM16:0, SM(18:0), SM(OH)16:1, SM(OH)24:1, SM(18:1), SM(16:1)) erwiesen sich als normalisiert, ebenso wie LysoPC 26:0, LysoPC 26:1, LysoPC 28:1 und LysoPC 28:0, Phenylalanin, Buttersäure und Propionsäure.

Die multivariate Analyse (PLS-DA) zeigte eine klare Trennung zwischen beiden Klassen (Genauigkeit: 1; R2: 0,98; Q2: 0,89) (Abb. 3c). Das VIP-Score-Diagramm (Abb. 3d) zeigt, dass die wichtigsten Variablen, die zur Unterscheidung von Negativkontrollen von Patienten mit langer COVID-19-Erkrankung verwendet werden können, Phenylalanin, Glutamin/Glutamat-Verhältnis, Taurin und Glutamin sind.

Innerhalb der Post-COVID-19-Gruppe wurden Unterschiede festgestellt, sowohl in der Häufigkeit der gemeldeten Symptome als auch in den Plasmaspiegeln einiger Metaboliten wie Milchsäure, mit einer bimodalen Verteilung innerhalb der Gruppe. Daher wurden diese Patienten gemäß unserer eigenen Skala als Ersatz für den Schweregrad der Erkrankung subklassifiziert. 18 Patienten berichteten über keine Symptome (genesenes oder nicht langes COVID). 18 Patienten berichteten über weniger als fünf anhaltende Symptome (Long-COVID der Klasse A), während 12 über mehr als fünf Symptome (Long-COVID der Klasse B) berichteten.

Wir haben den Ammoniakspiegel (in Form von Plasmaharnstoff) bei Patienten der Klasse B gemessen. Die Harnstoffkonzentration betrug in der COVID-19-Phase 43,8 ± 7,35 mg/dl und in der langen COVID-Phase 32,8 ± 3,1 mg/dl. Obwohl die Harnstoffwerte während der langen COVID-Phase niedriger waren (innerhalb normaler Werte), wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Phasen festgestellt (t-Test für gepaarte Proben, p = 0,146). Der Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) war bei allen Post-COVID-Patienten ähnlich.

Abbildung 4 zeigt die Box- und Whisker-Diagramme basierend auf einer einfachen ANOVA für Patienten der Klassen A, B und vollständig genesener Patienten. Das Laktat/Pyruvat-Verhältnis (angepasster p-Wert = 5,9 × 10–6), Laktat (angepasster p-Wert = 1,3 × 10–5), Arginin (2,0 × 10–3), Ornithin/Citrullin-Verhältnis (angepasster p-Wert 2,0 × 10). –3) waren die Variablen, die Long-COVID-Patienten mit mehr als fünf Symptomen am besten von Patienten mit weniger als fünf Symptomen unterscheiden konnten. Arginin korrelierte negativ mit der Anzahl der Symptome. Die Unterschiede im Glukosespiegel zwischen Klasse-A- und Klasse-B-Patienten erwiesen sich als nicht signifikant (p = 0,09). Um die Korrelation von Symptomen, signifikanten Variablen und den Labordaten zu bewerten, wurde eine Integration der Metadaten durchgeführt (ergänzende Abbildung 2). Eine negative Korrelation zwischen Arginin und verschiedenen Symptomen, einschließlich Angstzuständen (r = − 0,54), Müdigkeit (r = − 0,57), Konzentrationsverlust (r = − 0,53), Brustschmerzen (r = − 0,46) und Atemnot (r = −). 0,42), Myalgie (r = − 0,47), Arthralgie (r = − 0,42) sowie mit IL-17 (r = − 0,62) beobachtet.

Boxplots für einige signifikant veränderte Metaboliten und Verhältnisse (p < 0,05) im Plasma von Patienten der Klasse A (weniger als fünf Symptome), Patienten der Klasse B (mehr als fünf Symptome) und genesenen Patienten. Die Balkendiagramme zeigen die ursprünglichen und normalisierten Werte (Mittelwert +/− eine Standardabweichung). Die Mediane werden durch horizontale Linien innerhalb jedes Kästchens angezeigt.

Bei der Unterscheidung von Long-COVID-Patienten der Klasse B von allen anderen Post-COVID-19-Patienten zeigte das Laktat/Pyruvat-Verhältnis die beste Leistung (AUC: 0,94 (0,85–0,99), Sensitivität: 0,92 (0,87–0,97), Spezifität: 0,94 (0,91). –0,98.

Unsere Signalweganreicherungsanalyse (Abb. 5) zeigt, dass die fünf wichtigsten Stoffwechselwege, die bei Post-COVID-Patienten (im Vergleich zu den Kontrollen) signifikant fehlreguliert waren (FDR < 0,05), waren: Phospholipid-Biosynthese, Gluconeogenese, der Glucose-Alanin-Zyklus, der Warburg-Effekt, und Taurin- und Hypotaurinstoffwechsel. Beim Vergleich von Klasse-B-Patienten mit genesenen Patienten waren die fünf wichtigsten Stoffwechselwege (FDR < 0,05) folgende: Pyruvat-Metabolismus, Gluconeogenese, Glycin- und Serin-Metabolismus, Harnstoffzyklus-Metabolismus und der Warburg-Effekt.

Analyse der Stoffwechselwege. Die vorhergesagten Stoffwechselwege mit einem p-Wert ≤ 0,05 werden aufgelistet. (a) Kontrollpersonen im Vergleich zu Post-COVID-19-Patienten. (b) Patienten der Klasse B vs. genesene Patienten.

Abbildung 6 zeigt die mittels ELISA gemessenen Plasmakonzentrationen von IL-17 und Leptin. IL-17 war bei Patienten der Klasse B im Vergleich zu Patienten der Klasse A (Mann-Whitney-Test, p = 0,0073) und genesenen Patienten (Mann-Whitney-Test, p = 0,002) signifikant erhöht. Leptin zeigte im Dreigruppenvergleich keine statistisch signifikanten Unterschiede.

Durch ELISA gemessene Konzentrationen von IL-17 und Leptin bei Post-COVID-19-Patienten. Diagramme wurden in GraphPad Prism v8.0 erstellt. Der ** p-Wert < 0,01 wurde mithilfe von Kruskall-Wallis-Tests mit Dunn-Posttests berechnet.

Kumulative Beweise aus den letzten drei Jahren belegen die Fehlregulation von Stoffwechsel- und Immunmarkern aufgrund einer SARS-CoV-2-Infektion14. Eine retrospektive Kohortenstudie hat gezeigt, dass COVID-19-Patienten ein deutlich höheres Risiko haben, nachfolgende Autoimmunerkrankungen wie rheumatoide Arthritis, Morbus Bechterew, systemische Sklerose und Typ-I-Diabetes mellitus zu entwickeln15. Unser Ziel in der vorliegenden Arbeit war es, die Persistenz langfristiger Stoffwechselveränderungen bei Patienten mit langer COVID-19-Erkrankung zu bewerten und Immunmarker zu messen, die bei chronischer Produktion Autoimmunerkrankungen auslösen können.

Da für die Langzeit-COVID-Beurteilung keine klar definierten Klassifizierungs- oder Diagnosekriterien verfügbar sind, besteht ein dringender Bedarf an molekularen Methoden, mit denen Patienten nach der Schwere der Symptome, die sie erleben, stratifiziert werden können. Quantitative und validierte Skalen wie HAM-A, HAM-D, MoCA und mMRC gelten als Goldstandards für neurokognitive Beeinträchtigungen und zur Beurteilung von Dyspnoe. Ihr praktischer Nutzen könnte jedoch bei komplexen Erkrankungen wie Long-COVID begrenzt sein, bei denen ein breiteres Spektrum selbstberichteter Symptome mit unterschiedlichem Schweregrad und unterschiedlicher Dauer vorliegt. Es wurde berichtet, dass einige Langzeit-COVID-19-Patienten über extreme kognitive Störungen (selbstberichtete Symptome) klagen, jedoch ohne objektive Veränderungen, während andere keine Symptome berichten, aber nach 6 bis 9 Monaten nach SARS-CoV-2 schwere kognitive Störungen aufweisen Infektion16. In unserer Studie wurden mehrere Symptome durch objektive Messungen bestätigt, jedoch mit geringeren Raten bei Verwendung validierter Skalen. Für die korrekte Klassifizierung von Patienten werden daher dringend molekulare Marker benötigt.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass 50 % der analysierten Plasmametaboliten statistische Unterschiede zwischen COVID-19 und langen COVID-19-Phasen bei Patienten mit einer komplizierteren Entwicklung aufwiesen. Einer der am stärksten fehlregulierten Metaboliten war Glukose. Montefusco et al.17 berichteten über glykämische Anomalien bei genesenen Patienten zwei Monate nach Ausbruch der Krankheit. Es wurde berichtet, dass der hyperglykämische Zustand bei Krankenhauspatienten sogar noch schlimmer sei, was auf eine mögliche ursächliche Rolle verabreichter Arzneimittel, einschließlich Remdesivir und Kortikosteroide, hinweist. Diese Medikamente stimulieren die Glukoneogenese in der Leber aus Aminosäuren, die von den Muskeln freigesetzt werden, was dann die Glukoseaufnahme hemmt18. Langes COVID wurde mit einer neu auftretenden Insulinresistenz in Verbindung gebracht, die zum Auftreten depressiver Symptome beitragen kann, indem sie die allgemeine Neurotoxizität verstärkt19.

Es wurde auch festgestellt, dass eine Reihe anderer Metaboliten fehlreguliert sind. Erhöhte Pyruvatspiegel im Plasma könnten sowohl eine Folge einer glykolytischen Dysregulation als auch eines Proteinabbaus sein. Der Anstieg des Putrescinspiegels in der langen COVID-Phase könnte ein Hinweis auf einen erhöhten Proteinabbau sein, der den Pyruvatstoffwechsel ankurbelt.

Taurin und Spermidin waren in der langen COVID-Phase deutlich erniedrigt, obwohl im Vergleich zu den Kontrollen ein Trend zur Normalisierung zu beobachten war. Bei Patienten mit myalgischer Enzephalomyelitis/chronischem Müdigkeitssyndrom (ME/CFS)20 wurden verringerte Serum-Taurinspiegel beobachtet. Die in der langen COVID-19-Phase beobachteten erschöpften Werte könnten zumindest teilweise die Müdigkeit erklären, da Taurin mehrere Rollen in der Skelettmuskulatur, im Zentralnervensystem und im Energiestoffwechsel spielt. Basierend auf unseren Ergebnissen konnten wir jedoch keinen Zusammenhang zwischen Müdigkeit oder Myalgie und den Taurinkonzentrationen bei Patienten mit langer COVID-19-Erkrankung feststellen. Holmes et al.21 fanden heraus, dass der Taurinspiegel bei Patienten nach COVID-19 erhöht war, was auf eine Leberschädigung, Hepatotoxizität oder Muskelschädigung hindeutet. Die in der Holmes-Studie untersuchte Kohorte hatte jedoch eine dreimonatige Nachbeobachtungszeit nach der Erstinfektion, was viel kürzer ist als die in dieser Studie verwendete Nachbeobachtungszeit.

Darüber hinaus beobachteten wir erhöhte Kynureninspiegel und einen Trend zur Normalisierung des Tryptophans und des Kynurenin/Tryptophan-Verhältnisses bei Patienten mit langer COVID-19-Erkrankung. Dies weist darauf hin, dass die entzündlichen Zustände, die auf die Hyperaktivierung dieses Stoffwechselwegs zurückzuführen sind, auch wenn sie in geringerem Ausmaß vorliegen, immer noch vorhanden sind und für einige anhaltende physiologische Symptome bei diesen Patienten verantwortlich sein können. Erhöhte Hippursäurespiegel in der langen COVID-19-Phase könnten mit einer verbleibenden Darmdysbiose verbunden sein. Es wurde festgestellt, dass dieser Metabolit bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung und mehreren altersbedingten Erkrankungen erhöht ist22. Ein Anstieg des Plasmaspiegels von Hippursäure kann auch auf einen erhöhten Verzehr von Obst und Gemüse zurückzuführen sein.

Unsere Studie ergab erhöhte Mengen an Metaboliten, die mit dem Kollagenstoffwechsel bei Patienten mit langem COVID verbunden sind. Unter diesen Metaboliten ist Prolin aufgrund seiner Beteiligung an der Proteinstruktur und -funktion sowie seiner Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Redoxhomöostase durch die Erzeugung von ATP und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) während seines Katabolismus besonders hervorzuheben. Prolin kann aus Arginin durch verschiedene Enzyme synthetisiert werden, darunter Arginase (sowohl Typ I als auch Typ II), Ornithin-Aminotransferase und P5C-Reduktase23. Der Glutamat/P5C-Synthase-Weg im Darm ist für den Großteil der Prolinsynthese im Körper verantwortlich. Die erhöhten Prolinspiegel können durch Arginin- oder Glutaminwege verursacht werden, möglicherweise als Reaktion auf Hypoxie24 oder Gewebeschäden. Erhöhte Blutspiegel von Hydroxyprolin wurden als Biomarker für Krankheiten vorgeschlagen, die durch Fibrose gekennzeichnet sind, was auf einen erhöhten Bedarf an Prolin bei der Kollagensynthese hinweist. Transhydroxyprolin spielt eine entscheidende Rolle bei der Kollagensynthese und trägt zur thermodynamischen Stabilität der dreifach helikalen Konformation von Kollagen und damit verbundenen Geweben bei25. In unserer Studie kam es sowohl bei Patienten der Klasse A als auch bei Patienten der Klasse B zu einer teilweisen Lungenerholung, was durch anhaltende Veränderungen der Lungenfunktion belegt wurde, die in den Lungen-CT-Scans beobachtet wurden (ergänzende Abbildung 3). Die gemessenen Werte von trans-Hydroxyprolin zeigten jedoch keine signifikante Korrelation mit diesen Ergebnissen. Dennoch kann das mögliche Vorliegen von Kollagen-Gefäßerkrankungen nicht ausgeschlossen werden, da sie zu einer weiter verbreiteten systemischen Dysfunktion beitragen können, die manchmal mit Virusinfektionen einhergeht26.

Der Anstieg des Glutamins (und der Rückgang des Glutamatspiegels) weist auf eine teilweise Wiederherstellung kritischer Prozesse hin, die während der COVID-19-Infektionsphase stattgefunden haben, wie beispielsweise eine schwere immunmetabolische Dysregulation. Während der COVID-19-Phase wurde weithin ein Rückgang der zirkulierenden Glutaminspiegel beschrieben27,28,29,30,31,32. Dieser Abbau ist mit dem Verbrauch von Glutamin zur Erzeugung von ATP und Vorläufern (Purinen und Pyrimidinen) für die Synthese von Makromolekülen zum Zusammenbau von Nachkommenviren verbunden; um den TCA-Zyklus anzukurbeln (wie im Stoffwechsel von Krebszellen); zur Regulierung der Funktion von Immunzellen für maximale Zytokinproduktion, Lymphozytenfunktion und für das Wachstum, die Differenzierung von Plasma-T-Zellen und die Antikörperproduktion durch B-Lymphozyten; und um den Stickstoffaustausch zwischen den Organen, die Ammoniak-Entgiftung und die pH-Homöostase zu fördern. Der Glutamin/Glutamat-Weg ist daher eng mit dem Energiestoffwechsel verbunden. Fehlregulationen in dieser Achse wurden bisher mit einem erhöhten Risiko für Typ-2-Diabetes und andere entzündliche Erkrankungen in Verbindung gebracht33,34. In der Post-COVID-Phase hingegen könnten ein Anstieg der Glutaminkonzentration und ein Rückgang des Glutamats (höheres Glutamin/Glutamat-Verhältnis) mit einer langfristigen Erholung verbunden sein, da der Bedarf an Glutamin für die Immunaktivierung, die Nukleotidsynthese und die Ammoniakentgiftung gestiegen ist verringert. Bei Langzeit-COVID-Patienten mit mehreren Symptomen (neuropsychiatrisch und systemisch) bleibt die Immundysregulation jedoch bestehen, was zu einem anhaltenden Ungleichgewicht im Glutamin-/Glutamatstoffwechsel führt, da Glutamin als Signalmetabolit fungieren kann. Eine Störung des glutamatergen Signalwegs kann zu schwerwiegenden neurologischen Folgen wie kognitiven Defiziten führen35,36. Tatsächlich wurde berichtet, dass diese äußerst empfindliche Glutamin/Glutamat-Homöostase bei Schizophrenie37 und frontotemporaler Demenz38 gestört ist. Die glutaminerge Dysfunktion könnte mit einigen psychiatrischen und neurologischen Symptomen verbunden sein, wie sie in der vorliegenden Arbeit beschrieben werden.

Bei den meisten Patienten mit langer COVID-19-Erkrankung sind Veränderungen im Fettstoffwechsel erkennbar. Diese Patienten wiesen deutlich höhere Carnitinspiegel und einige kurze, mittlere und lange Acylcarnitine auf. Diese Veränderungen wurden größtenteils mit einem veränderten Fettsäurestoffwechsel, einem gestörten mitochondrienabhängigen Lipidkatabolismus und Immunprozessen oder der Lyse weißer Blutkörperchen in Verbindung gebracht. Ähnliche Ergebnisse wurden von Guntur et al.39 berichtet, die auf eine mitochondriale Dysfunktion hinweisen, die auch während der akuten Phase von COVID-19 erkannt wurde. Darüber hinaus wurden im Vergleich zu den Negativkontrollen verringerte Werte von LysoPC 16:0, LysoPC 17:0, LysoPC 18:0 und LysoPC 20:4 festgestellt. Diese Verringerungen wurden bei anderen entzündlichen Erkrankungen40 und anderen septischen Prozessen41 berichtet. Ein Mangel an Lysophosphatidylcholinen und Phospholipidethern sowie ein Mangel an PCs können die mitochondriale Atmung behindern, wie auch bei ME/CFS gezeigt wurde42. Im Einklang mit der durch die gezielte Stoffwechselanalyse nachgewiesenen Lipiddysregulation zeigten routinemäßige klinische Labortests erhöhte Werte für Gesamtcholesterin, Triglyceride und VLDL sowie normale Werte für HDL und LDL. Xu et al.43 fanden bei Überlebenden von COVID-19 erhöhte LDL-, Triglycerid-, Gesamtcholesterin- und HDL-Werte, basierend auf einer großen Beobachtungsstudie mit Teilnehmern aus der Datenbank des US-Veteranenministeriums im Vergleich zu Kontrollpersonen, die noch nie positiv auf COVID getestet worden waren -19.

Als positive Ergebnisse für den Stoffwechselzustand von Long-COVID-Patienten stellten wir fest, dass 30 Metaboliten im Normbereich lagen. Phenylalanin, das weithin mit Sepsis und der Schwere der COVID-Erkrankung in Verbindung gebracht wird14, sank auf normale Werte. Beta-Hydroxybuttersäure und Zitronensäure wurden ebenfalls normalisiert, was auf eine teilweise Wiederherstellung des Tricarbonsäurezyklus hinweist14,44. Buttersäure und Propionsäure, zwei kurzkettige Fettsäuren, die während der COVID-19-Phase verändert waren, fielen bei Post-COVID-19-Patienten ebenfalls auf normale Werte, was wahrscheinlich darauf hindeutet, dass das Leaky-Gut-Phänomen und die Darmdysbiose während der COVID-19-Erkrankung festgestellt wurden Die Infektion konnte teilweise wiederhergestellt werden45. Spermidin wurde ebenfalls normalisiert. Der Rückgang des Spermidinspiegels könnte einen Trend zur Normalisierung des gesamten Redoxgleichgewichts widerspiegeln. Obwohl übermäßige Spermidinspiegel (wie sie bei COVID-19-Patienten berichtet wurden) die Produktion von Superoxidradikalen auslösen, mildern optimale Konzentrationen oxidativen Stress und verringern die gesamte ROS-Produktion46.

Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Sphingomyeline und langkettige einfach ungesättigte und gesättigte LysoPCs im normalen Bereich liegen. Wir haben zuvor veränderte Sphingolipidspiegel während einer COVID-19-Infektion festgestellt14. Sphingolipide spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Signaltransduktionswegen und bei bestimmten pathologischen Zuständen, wie z. B. entzündungsbedingten Erkrankungen und der angeborenen Immunantwort.

In einem aktuellen Bericht stellten Holmes et al.21 ein hohes Maß an interindividueller Variabilität bei Nachbeobachtungspatienten fest, was die Heterogenität von Post-COVID-19-Patienten und die Tatsache widerspiegelt, dass es sich bei Long-COVID um ein Spektrum von Erkrankungen handelt. Tatsächlich ergab die rechnerische Modellierung der Long-COVID-Phänotypdaten auf der Grundlage elektronischer Gesundheitsakten sechs verschiedene Cluster mit jeweils unterschiedlichen Profilen phänotypischer Anomalien47. Da die Symptomklassifizierung immer noch sehr subjektiv ist, haben wir uns entschieden, Patienten mit langem COVID willkürlich in Klasse A (weniger als fünf Symptome, hauptsächlich neuropsychiatrische Störungen) und Klasse B (mehr als fünf Symptome, mit einem breiten Spektrum systemischer Störungen) zu klassifizieren. In einem kürzlich erschienenen Artikel48 schlugen die Autoren eine Definition von PASC vor, die auf selbstberichteten Symptomen basiert und vier verschiedene Cluster mit Begleitsymptomen im Bereich von zwei bis sechs identifiziert, um der Heterogenität von Long-COVID Rechnung zu tragen. Die vier PASC-Untergruppen wurden wie folgt identifiziert: Cluster 1: Verlust oder Veränderung des Geruchs oder Geschmacks; Cluster 2: Unwohlsein und Müdigkeit nach Belastung; Cluster 3: Gehirnnebel, Unwohlsein nach Belastung und Müdigkeit; Cluster 4: Müdigkeit, Unwohlsein nach Belastung, Schwindel, Gehirnnebel, gastrointestinale Symptome und Herzklopfen. Unsere eigene Klassifizierungsskala stimmt mit dieser Studie überein, sowohl hinsichtlich der Anzahl als auch der Art der einbezogenen Symptome.

Wir glauben, dass Stoffwechselinformationen die phänotypischen Unterschiede zwischen Patienten mit langer COVID-19-Erkrankung ergänzen und teilweise erklären können. Xu et al.49 klassifizierten genesene Patienten anhand abnormaler Lungenfunktionen und stellten bei Patienten mit abnormaler Lungenfunktion erhöhte Werte von Triacylglycerinen, Phosphatidylcholinen, Prostaglandin E2 und Arginin sowie verringerte Werte von Betain und Adenosin fest.

In unserer Arbeit waren die Milchsäurewerte bei Patienten mit mehr als fünf Symptomen und systemischen Störungen (Klasse-B-Patienten) erhöht. Ghali et al.50 fanden heraus, dass Patienten mit ME/CFS im Ruhezustand einen erhöhten Laktatspiegel im Blut aufwiesen. Mitochondriale Dysfunktion mit erhöhtem Blutlaktat, niedrigem ATP-Spiegel und erhöhten Werten an Markern für oxidativen Stress wurde mit diesen Veränderungen in Verbindung gebracht51, ebenso wie ein relativer Mangel an Mitochondrien-Typ-I-Fasern in Muskelbiopsien und ein niedriger intrazellulärer pH-Wert während der Erholungsphase52,53 ,54. De Boer et al.55 berichteten auch über veränderte Laktatspiegel bei Long-COVID-Patienten, was darauf hindeutet, dass Long-COVID-Patienten eine erhebliche Beeinträchtigung der Fett-Beta-Oxidation und eine erhöhte Laktatansammlung im Blut haben, selbst bei Übungen mit geringer Intensität. Im Gegensatz dazu berichteten Guntur et al.39 über niedrige Milchsäure- und Pyruvatspiegel bei Patienten mit langem COVID. Diese Studie wurde jedoch an nicht hospitalisierten Patienten durchgeführt, die sich im März 2020 von COVID-19 erholt hatten.

Ein erhöhter Wert des Laktat/Pyruvat-Verhältnisses bei Patienten der Klasse B ist ein weiterer wichtiger Indikator für eine mitochondriale Dysfunktion. Das Laktat/Pyruvat-Verhältnis wurde als Marker für mitochondriale Störungen vorgeschlagen, da es indirekt den NADH/NAD+-Redoxzustand56, den Lipidstoffwechsel (Fettoxidation) und die ATP-Erzeugung widerspiegelt. In unserer Studie wurde festgestellt, dass beide Marker (Laktat und das Laktat/Pyruvat-Verhältnis) positiv mit Müdigkeit, Myalgie und Arthralgien korrelieren (Spearman-Korrelation, R > 0,6, p < 0,05).

Das erhöhte Ornithin/Citrullin-Verhältnis bei Patienten der Klasse B spiegelt eine abnormale Stoffwechselaktivität im Harnstoffzyklus wider. Es ist bemerkenswert, dass Yamano et al.57 über ein ähnlich erhöhtes Ornithin/Citrullin-Verhältnis bei CFS-Patienten berichteten. Ein ausreichendes Gleichgewicht von Citrullin und Ornithin ist für die Clearance von Ammoniak über den Harnstoffzyklus von entscheidender Bedeutung58. Wenn sich Ammoniak intrazellulär ansammelt, wird die aerobe Verwertung von Pyruvat zur Versorgung des TCA-Zyklus gehemmt, was zur Laktatproduktion führt, was weiter zur Müdigkeit beiträgt.

Darüber hinaus hatten Patienten der Klasse B im Vergleich zu den anderen Untergruppen einen verringerten Argininspiegel. Die verringerte Bioverfügbarkeit von Arginin zur Produktion ausreichender Stickoxidmengen in Endothelzellen und Gefäßgeweben führt zur Beeinträchtigung mehrerer physiologischer Funktionen der Skelettmuskulatur, einschließlich kontraktiler Funktionen und der Muskelreparatur59. Arginin ist auch ein Substrat für die Ornithinproduktion durch Arginase. Es ist bekannt, dass bei bestimmten entzündlichen Erkrankungen die Arginase-Aktivität erhöht ist59, was zu einem Überschuss an Ornithin und einem Ungleichgewicht im Harnstoffzyklus führt.

Frühere Studien haben auf eine anhaltende Immunschwäche nach einer COVID-19-Infektion hingewiesen60. Wir fanden erhöhte Monozytenwerte bei Patienten der Klasse B. Nuber-Champier et al.61 fanden heraus, dass der Monozytenanteil in der akuten Phase der Krankheit es ihnen ermöglichte, zwischen Patienten mit Anosognosie aufgrund von Gedächtnisdefiziten in der chronischen Phase (6–9 Monate nach der SARS-CoV-2-Infektion) und nosognosischen Patienten zu unterscheiden.

Wir haben auch die IL-17-Spiegel bei Post-COVID-19-Patienten gemessen, da bekannt ist, dass dieses Zytokin bei mehreren chronisch entzündlichen und Autoimmunerkrankungen dauerhaft verändert ist62 und frühere Berichte auf ein erhöhtes Risiko für solche Erkrankungen bei COVID-19-Patienten hingewiesen haben15. IL-17 ist ein proinflammatorisches Zytokin, das hauptsächlich von T-Helferzellen vom Typ 17 produziert wird und eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Immunantwort des Wirts gegen SARS-CoV-2 spielt. Es wurde gezeigt, dass IL-17-induzierte fehlregulierte Immunantworten möglicherweise eine hyperinflammatorische COVID-19-Erkrankung verursachen63. Es wurde berichtet, dass IL-17 die Proteinphosphatase 6 herunterreguliert, was zu einer erhöhten Arginase-1-Expression in Psoriasis-Keratinozyten führt64. Es wurde festgestellt, dass IL-17A bei Post-COVID-19-Patienten mit neurologischen Folgen und Lungenfibrose assoziiert ist65,66. Schwankungen von IL-17 wurden mit Müdigkeit und Schweregrad der Müdigkeit bei ME/CFS-Patienten in Verbindung gebracht67. Darüber hinaus haben wir Leptin gemessen, da angenommen wird, dass es entzündliche Müdigkeit verursacht. Leptin wird hauptsächlich im Fettgewebe produziert und spielt eine Rolle bei der Regulierung der Nahrungsaufnahme, des Grundstoffwechsels und der β-Oxidation von Fettsäuren. Bei Stoffwechselerkrankungen wie Fettleibigkeit werden chronisch erhöhte Leptinspiegel beobachtet, die die Produktion entzündungsfördernder Moleküle induzieren und die Selbsttoleranz des Immunsystems beeinträchtigen können, was die Entwicklung von Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis, entzündlichen Darmerkrankungen, Multipler Sklerose und anderen prädisponiert68. Erhöhte Leptinspiegel wurden bei Menschen mit CFS69 mit höheren Müdigkeitswerten in Verbindung gebracht. In einer von Stringer et al.69 durchgeführten Studie zeigten die Autoren, dass der tägliche Schweregrad der Müdigkeit signifikant mit dem täglichen Serum-Leptinspiegel bei Frauen mit CFS korreliert. Allerdings fanden wir in unserer Studie keine statistischen Unterschiede in den Leptinspiegeln, obwohl wir bei Patienten der Klasse B höhere Werte beobachteten. Basierend auf unseren Ergebnissen kann der Leptinspiegel nicht mit Müdigkeit in Verbindung gebracht werden, was darauf hindeutet, dass die Wirkung von IL-17 auf Stoffwechselwege in dieser Hinsicht eine wichtigere Rolle spielen könnte.

Die Metabolomik ist nicht nur nützlich, um eine Momentaufnahme vorübergehender physiologischer oder pathophysiologischer Prozesse in einem lebenden Organismus zu liefern, sondern sie hat sich auch als leistungsstarkes Instrument zum Vorschlagen und Überwachen therapeutischer Interventionen erwiesen. Im Falle einer langen COVID-Erkrankung kommt es weltweit häufig vor, dass Patienten über mangelnde angemessene Unterstützung und mangelndes Verständnis ihrer Erkrankung berichten, was zunächst auf psychiatrische Probleme zurückgeführt wurde. Menschen mit langem COVID haben eine Vielzahl selbst verschriebener Medikamente, Nahrungsergänzungsmittel, Heilmittel und Ernährungsumstellungen ausprobiert, um die Krankheit in den Griff zu bekommen und die Auswirkungen auf ihre Lebensqualität und Arbeitsfähigkeit zu überwinden. Basierend auf unseren Erkenntnissen könnten einige Interventionen zur Behandlung von Long-COVID-Patienten getestet werden: (1) Ergänzung mit Taurin (Reduzierung von Muskel-Skelett-Erkrankungen); (2) Ergänzung mit Citrullin (Verbesserung der Ammoniak-Clearance und Reduzierung des Blutlaktats sowie Erhöhung der Bioverfügbarkeit von Arginin für eine angemessene NO-Produktion); (3) Ergänzung mit Glutamin (Hauptquelle für Neurotransmitter und Ausgleich der Immunfunktion); (4) Ergänzung mit Antioxidantien wie N-Acetylcystein oder NAD+ (Redox-Balance); (5) Ergänzung mit Arginin (zur Bekämpfung der endothelialen Dysfunktion bei Long-COVID), wie bereits von Tosato et al.70 vorgeschlagen. Die in unseren Ergebnissen gefundenen Ähnlichkeiten mit der ME/CFS-Pathophysiologie könnten den Weg für gemeinsame therapeutische Interventionen für beide Krankheiten ebnen.

Wir müssen bei dieser Studie mehrere Einschränkungen anerkennen. Die geringe Stichprobengröße war auf die begrenzte Anzahl von Patienten zurückzuführen, die einer Teilnahme zustimmten. Während mehrere objektive Messungen der Stimmung und Kognition (HAM-A, HAM-D, MoCA mMRC) verwendet wurden, erlaubte die Stichprobengröße keine Stratifizierung der Patienten nach den verschiedenen erhaltenen Testergebnissen und es wurden nur selbstberichtete Symptome verwendet Untergruppenklassifizierung. Darüber hinaus konnten wir im untersuchten Zeitraum keine detaillierte Nachverfolgung von Behandlungen, Medikamenten oder alternativen Therapien durchführen. Dies schränkte unsere Interpretation hinsichtlich der Auswirkungen pharmakologischer Eingriffe auf das Metabolom ein. Außerdem wurden einige Verbindungen wie Hexosen durch Direktinjektion (DI) gemessen; Daher war es nicht möglich, Glucose (den am häufigsten vorkommenden Zucker) von seinen Epimeren zu unterscheiden. Wir hatten keinen Zugriff auf Ct-Werte aus den elektronischen Patientenakten, die die anfängliche Viruslast angeben. Alle Patienten waren mit dem ursprünglichen Stamm infiziert, der im Jahr 2020 der vorherrschende Stamm war. Es gibt nur begrenzte Studien, die den Zusammenhang zwischen der anfänglichen Viruslast, bestimmt durch Ct-Werte, und den verschiedenen Langzeiteffekten von COVID-19 untersuchen71. Eine in Mexiko durchgeführte Studie ergab, dass bei Patienten mit einem niedrigen Ct-Wert zwischen 15 und 20 Symptome auftraten, während bei Patienten mit einem hohen Ct-Wert weniger als sechs Symptome auftraten. Asymptomatische Patienten mit Ct-Werten zwischen 33 und 36 zeigten keine oder nur sehr wenige Post-COVID-19-Symptome72. In größeren Studien, die in jüngerer Zeit durchgeführt wurden73, hat sich der Schwerpunkt jedoch auf die Viruspersistenz als potenziellen Mechanismus für langes COVID verlagert, anstatt nur die anfängliche Viruslast zu berücksichtigen.

An unserer Studie nahmen Patienten aus zwei verschiedenen Krankenhäusern teil: einem privaten Krankenhaus in der Stadt Chihuahua und einem öffentlichen Krankenhaus in der Stadt Zacatecas. Im Allgemeinen verfügen private Krankenhauspatienten über ein relativ hohes Einkommen, während öffentliche Krankenhauspatienten über ein niedrigeres Einkommen verfügen. Logistische Regressionsmodelle zeigten keine Auswirkungen von Geschlecht, Alter, Komorbiditäten, Impfstatus oder Schweregrad während der akuten Phase auf das mit Long-COVID verbundene metabolische Profil. Patienten aus dem öffentlichen Krankenhaus berichteten jedoch im Allgemeinen über mehr systemische Symptome, während Patienten aus dem privaten Krankenhaus hauptsächlich über neuropsychiatrische Symptome berichteten. Eine aktuelle Studie ergab, dass Patienten, bei denen eine Post-COVID-19-Erkrankung diagnostiziert wurde, mit größerer Wahrscheinlichkeit arbeitslos waren oder in der öffentlichen Krankenversicherung versichert waren, was zumindest in den USA rassische und soziale Unterschiede beim Zugang zur Gesundheitsversorgung und bei der Erfahrung damit verdeutlicht74. Ob die sozioökonomischen Bedingungen und Lebensstile sowie Ursachen biologischen Ursprungs die metabolische Phenoreversion der in unsere Studie rekrutierten Patienten beeinflussen, muss weiter untersucht werden. Dies ist besonders wichtig in Ländern mit erheblichen Ungleichheiten im Gesundheitssystem und erheblichen Unterschieden in den Lebensbedingungen der Bevölkerung.

Zum Zeitpunkt dieser Studie wurden die meisten der im Jahr 2020 rekrutierten Negativkontrollen in nachfolgenden Wellen im Jahr 2021 oder 2022 positiv auf COVID-19 getestet. Daher konnten wir die Prävalenz von Symptomen bei Post-COVID-19-Patienten nicht mit einer nicht vergleichen -COVID-19 passende Gruppe. In einer von Ballering et al.75 durchgeführten Studie waren von den 76.422 längsschnittlich befragten Teilnehmern vor und nach COVID-19 4.231 (5,5 %) an COVID-19 erkrankt und wurden mit 8.462 entsprechenden Kontrollpersonen verglichen. Der Anteil der Teilnehmer, die mindestens ein Kernsymptom mit deutlich erhöhtem bis mindestens mäßigem Schweregrad aufwiesen, betrug 21,4 % bei den COVID-19-Teilnehmern gegenüber 8,7 % bei den Kontrollpersonen, was darauf hindeutet, dass die Kernsymptome bei 12,7 % der Teilnehmer auf COVID-19 zurückzuführen waren. Diese Zahlen steigen derzeit, da weltweit mehr epidemiologische Daten gemeldet werden.

Nach unserem Kenntnisstand ist diese Studie die erste, die quantitative Stoffwechselstörungen zwei Jahre nach der ersten akuten COVID-19-Infektion mithilfe gezielter Metabolomik beschreibt. Die Entwicklung von Post-COVID-19-Patienten ist unterschiedlich und die Symptome sind mit charakteristischen Stoffwechselmustern verbunden, die in gewissem Maße der ME/CSF-Erkrankung ähneln. Darüber hinaus offenbaren die beobachteten Unterschiede zwischen den Phänotypen von Post-COVID-19-Patienten potenzielle Biomarker, die, sobald sie in größeren und heterogenen Populationen validiert und zusammen mit klinischen und soziodemografischen Daten integriert werden, eine genauere und präzisere Klassifizierung von Langzeit-COVID-19-Patienten darüber hinaus ermöglichen werden Klassifizierung anhand selbstberichteter Symptome.

Für die Ziele dieser Studie wurden Überlebende von COVID-19-Patienten (mit bestätigter Diagnose basierend auf einer positiven PCR für SARS-CoV-2) berücksichtigt, die eine leichte, schwere oder kritische Erkrankung entwickelten und im Instituto Mexicano aufgenommen (oder ins Krankenhaus eingeliefert) wurden de Seguridad Social (Zacatecas-Stadt, Mexiko) und das Christus Muguerza del Parque Hospital (Chihuahua-Stadt, Mexiko) zwischen März und November 2020 wurden rekrutiert. Die Teilnehmer wurden für ein persönliches Interview kontaktiert. Sie wurden eingeladen, einen Fragebogen zu beantworten und eine Blutprobe zu spenden. Aus dem gespendeten Blut wurde Plasma isoliert. COVID-19-Patienten des Instituto Mexicano de Seguridad Social wurden aus einer anfänglichen Gruppe von 124 COVID-19-Patienten rekrutiert, die an einer früheren Forschungsstudie teilgenommen hatten76. Davon verstarben 44 (35,6 %) während des Krankenhausaufenthalts und in den darauffolgenden Monaten nach der Entlassung aus dem Krankenhaus. Von den 80 Überlebenden konnten 36 kontaktiert werden (über ihre Sozialversicherungsnummer oder die in den Krankenhausunterlagen gespeicherte persönliche/verwandte Telefonnummer), und 15 stimmten der Teilnahme zu. Für diese 15 Patienten standen gepaarte Plasmaproben aus der Erstdiagnose der akuten Erkrankung (COVID-19-Gruppe) und der Post-COVID-Phase zur Verfügung.

Darüber hinaus wurden aus einer Kohorte von Patienten, die im Jahr 2020 im Krankenhaus Christus Muguerza del Parque hospitalisiert wurden, 33 nach Altersstratifizierung zufällig ausgewählt. Für diese Patienten war keine Basalblutprobe verfügbar; Allerdings wurden alle klinischen Informationen und Thorax-Computertomographie-Scans (CT) im Krankenhausarchiv aufgezeichnet.

Für die neuropsychologische Beurteilung wurde die validierte Hamilton Anxiety Rating Scale (HAM-A)77 verwendet. Zur Beurteilung der Depression wurde die Hamilton-Depressionsskala (HAM-D) verwendet78. Bei kognitiven Beeinträchtigungen wurde das Montreal Cognitive Assessment (MoCA) eingesetzt79. Zur Beurteilung der Dyspnoe wurde die modifizierte Dyspnoe-Skala des Medical Research Council (mMRC) implementiert80. Bei allen eingeschlossenen Patienten wurden grundlegende biochemische Blutmarker durchgeführt (z. B. Hämoglobin, Blutplättchen, Leukozyten, Lymphozyten und Kreatinin).

Um Unterschiede im Schweregrad von Langzeit-COVID-Patienten festzustellen, wurde (willkürlich) eine eigene Klassifizierung unter Berücksichtigung der Häufigkeit der Begleitsymptome vorgenommen. Als genesene Patienten wurden diejenigen eingestuft, die keine anhaltenden Symptome meldeten. Long-COVID wurde in Betracht gezogen, wenn Patienten über mindestens ein anhaltendes neurologisches, psychiatrisches, gastrointestinales, kardiologisches, respiratorisches oder systemisches Symptom berichteten. Bei den Long-COVID-Patienten der Klasse A handelte es sich um diejenigen, die über weniger als fünf anhaltende Symptome berichteten (17 Patienten), während bei den Long-COVID-Patienten der Klasse B diejenigen waren, die über fünf oder mehr anhaltende Symptome berichteten (13 Patienten). Als Negativkontrollen und Indikator für die Normalbevölkerung wurden gelagerte Plasmaproben von 37 Personen verwendet, die im Jahr 2020 negativ auf SARS-CoV-2 getestet wurden.

Es wurde eine Kombination aus Direktinjektions-Massenspektrometrie und einem benutzerdefinierten Reverse-Phase-LC-MS/MS-Assay verwendet, wie zuvor beschrieben76. Kurz gesagt, Metaboliten wurden mit einem lokal entwickelten LC-MS/MS-Metabolomics-Assay namens The Metabolomics Innovation Center (TMIC) Prime (TMIC PRIME®) Assay gemessen. Dieser Assay liefert quantitative Ergebnisse für bis zu 143 endogene Metaboliten, darunter biogene Amine, Aminosäuren, organische Säuren, Lipide und lipidähnliche Verbindungen.

Die Methode kombiniert die Derivatisierung und Extraktion von Analyten mit der selektiven massenspektrometrischen Detektion mithilfe mehrerer Reaktionsüberwachungspaare (MRM). Zur Metabolitenquantifizierung wurden isotopenmarkierte interne Standards und andere interne Standards verwendet. Der benutzerdefinierte Assay verwendet eine 96-Deep-Well-Platte mit einer mit Dichtungsband befestigten Filterplatte sowie Reagenzien und Lösungsmittel, die zur Vorbereitung des Plattenassays verwendet werden. Die ersten 14 Wells der 96-Well-Platte wurden zur Kalibrierung und Qualitätskontrolle mit einem Doppelblindwert, drei Nullproben, sieben Kalibrierungsstandards und drei Qualitätskontrollproben verwendet. Um alle Metaboliten außer organischen Säuren zu messen, wurden die Proben zunächst auf Eis aufgetaut und gevortext. 10 µL jeder Probe wurden in die Mitte des Filters auf der oberen 96-Well-Platte gegeben und unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Anschließend wurde Phenylisothiocyanat (PITC) zur Derivatisierung zugegeben. Nach der Inkubation wurden die Filterspots erneut mit einem Verdampfer getrocknet. Die Extraktion der Metaboliten erfolgte dann durch Zugabe von 300 µL Extraktionslösungsmittel. Die Extrakte wurden durch Zentrifugation in der unteren 96-Well-Platte und anschließendem Verdünnungsschritt mit dem Massenspektrometrie-Lösemittel gewonnen.

Für die Analyse organischer Säuren wurden 150 µL eiskaltes Methanol und 10 µL einer isotopenmarkierten internen Standardmischung zu 50 µL jeder Plasmaprobe zur Proteinfällung über Nacht hinzugefügt. Anschließend wurde jede Probe 15 Minuten lang bei 13.000 × g zentrifugiert. 50 µL Überstand wurden in die Mitte der Vertiefungen einer 96-Well-Platte gegeben, gefolgt von der Zugabe von 13C-markiertem 3-Nitrophenylhydrazin (3-NPH) als Isotopenmarkierungsreagenz (zur Quantifizierung). Nach 2-stündiger Inkubation wurden vor der LC-MS-Injektion butyliertes Hydroxytoluol (als Stabilisator) und Wasser zugegeben.

Die massenspektrometrische Analyse der PITC- und 3-NPH-derivatisierten Proben wurde auf einem Tandem-Massenspektrometriegerät ABSciex 4000 Qtrap® (Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies, Foster City, CA) durchgeführt, das mit einem UHPLC-System der Agilent 1260-Serie ausgestattet war. Organische Säuren, biogene Amine, Aminosäuren und Aminosäurederivate wurden mittels LC-MS nachgewiesen und quantifiziert, während Lipide, Acylcarnitine und Glucose mittels einer Direktinjektionsmethode (DI) nachgewiesen und quantifiziert wurden.

Für die quantitative Analyse wurden Analyst 1.6.2 und MultiQuant 3.0.3 verwendet. Zur Quantifizierung organischer Säuren, Aminosäuren, biogener Amine und Derivate wurde eine individuelle Sieben-Punkte-Kalibrierungskurve erstellt. Verhältnisse für die Signalintensität jedes Analyten zu seinem entsprechenden isotopenmarkierten internen Standard wurden gegen die spezifischen bekannten Konzentrationen unter Verwendung einer quadratischen Regression mit einer 1/x2-Gewichtung aufgetragen. Für Lipide, Acylcarnitine und Glucose wurde eine Einzelpunktkalibrierung eines repräsentativen Analyten unter Verwendung derselben Gruppe von Verbindungen mit derselben Kernstruktur unter der Annahme einer linearen Regression durch Null erstellt.

ELISA-Kits wurden zur Quantifizierung von IL-17 (Katalognummer RAB0262, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) und Leptin (Katalognummer ab108879, Abcam, Cambridge, UK) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt, Standardlösungen (oder Plasmaproben) wurden zu jedem Typ vorbeschichteter 96-Well-Platte gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Platten mit den entsprechenden Nachweisantikörpern (100 μL/Well) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde jeder Vertiefung Streptavidin-Lösung (100 μl) zugesetzt und die Platten wurden 45 Minuten lang inkubiert. Nach der Antikörper-HPR-Inkubation wurde TMB-Einstufen-Substratreagenz (100 μl) in die Vertiefungen gegeben und die Platten weitere 30 Minuten lang inkubiert, bevor eine Stopplösung (50 μl/Vertiefung) hinzugefügt wurde. Die Absorptionswerte (bei 450 nm) wurden zur Berechnung der Proteinkonzentrationen (pg/ml) verwendet, indem die Absorption mit einer geeigneten Standardkurve verglichen wurde.

Zur Beschreibung der Ausgangsmerkmale von Negativkontrollen (nicht-COVID-19), COVID-19- oder Post-COVID-19-Patienten wurden Mediane mit Interquartilbereichen (IQRs) oder Mittelwerten [mit Standardabweichungen (sd)] und Häufigkeiten (%) verwendet für kontinuierliche bzw. kategoriale Daten. Die Normalität wurde mithilfe des D'Agostino-Pearson-Normalitätstests beurteilt. Für kontinuierliche Daten wurden der Student-t-Test oder der Mann-Whitney-Test verwendet. Für kategoriale Variablen (z. B. Geschlecht, Rauchen, Symptome und Komorbiditäten) wurden Chi2-Tests nach Pearson oder exakte Tests nach Fisher verwendet. Alle p-Werte unter 0,05 (p < 0,05) wurden als statistisch signifikant angesehen. Die Analysen wurden mit SPSS (IBM, Version 24) durchgeführt.

Die Metabolitenanalyse wurde mit MetaboAnalyst 5.081 durchgeführt. Die Metaboliten mit mehr als 20 % fehlenden Werten wurden aus der weiteren Analyse entfernt. Für die übrigen Metaboliten wurden Werte unterhalb der Nachweisgrenze (LOD) unter Verwendung von 1/5 des minimalen positiven Werts jeder Variablen unterstellt. Die Daten wurden dann einer automatischen Skalierung unterzogen, um geeignete Gaußsche Metabolitenkonzentrationsverteilungen zu generieren. Unterschiede in den mittleren Stoffwechselwerten zwischen Kontrollpersonen, COVID-19-, Post-COVID-19- und Langzeit-COVID-Patienten wurden mithilfe eines parametrischen t-Tests oder einer einfaktoriellen ANOVA [angepasster p-Wert (FDR)-Grenzwert = 0,05] bewertet. Für die gepaarte Studie wurden T-Test- und Vulkandiagramme logarithmisch transformierter p-Werte erstellt, um wichtige Metaboliten zu berücksichtigen. Die Ergebnisdiagramme der Hauptkomponentenanalyse (PCA) und der zweidimensionalen partiellen Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (2-D PLS-DA) wurden verwendet, um Plasmametabolitendaten über und zwischen Studiengruppen zu vergleichen; 2000-fache Permutationstests wurden verwendet, um die statistische Signifikanz zu bewerten und die Möglichkeit zu minimieren, dass die beobachtete Trennung der PLS-DA-Cluster zufällig war. Differenzierte Metaboliten wurden durch eine variable Wichtigkeit in der Projektion (VIP) unter Verwendung eines Score-Cutoffs von > 1,5 identifiziert. Heatmaps der 50 wichtigsten Metaboliten (mittels T-Test oder ANOVA) wurden über MetaboAnalyst erstellt.

Die Pathway-Analyse wurde mit den Modulen Metabolite Set Enrichment Analysis (MSEA) und Metabolomic Pathway Analysis (MetPA) durchgeführt, wie sie in MetaboAnalyst 5.081 zu finden sind. Für die Signalweganalyse wurde die Signalwegbibliothek des Homo sapiens verwendet. Der globale Test wurde für die ausgewählte Methode zur Analyse der Signalweganreicherung verwendet, während das Knotenwichtigkeitsmaß für die topologische Analyse zur Bewertung der relativen Zwischenzentralität verwendet wurde.

Die Metaboliten mit den höchsten VIP-Werten wurden verwendet, um Metaboliten-Panels zur Vorhersage von Long-COVID mithilfe multivariater logistischer Regression zu erstellen. Darüber hinaus wurden die Modelle hinsichtlich relevanter potenzieller Störfaktoren wie Geschlecht, Alter, relevanter Komorbiditäten (z. B. DM-II, HTN und Fettleibigkeit) angepasst, sodass in den endgültigen Modellen nur statistisch signifikante Variablen (p < 0,05) verblieben. Mit den automatisch skalierten Daten wurde eine logistische Regressionsanalyse durchgeführt. Um sicherzustellen, dass die logistischen Regressionsmodelle robust sind, wurde eine K-fache Kreuzvalidierung (CV) verwendet. Um die Leistung jedes generierten Modells zu bestimmen, wurde die Fläche unter der Receiver Operating Characteristics-Kurve (AUROC oder AUC) sowie Sensitivität und Spezifität berechnet.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki (1976) durchgeführt. Es wurde außerdem von den Forschungs- und Ethikkommissionen des Instituto Mexicano de Seguridad Social mit der Registrierungsnummer R-2022-3301-038 und des Krankenhauses Christus Muguerza del Parque (HCMP-CEI-15042020-3 und HCMP-CEI-15042020-3) überarbeitet und genehmigt. CEI-28022022-A01). Von allen Teilnehmern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Alle in diese Studie einbezogenen Patienten wurden schriftlich über die Entnahme ihrer Proben zu Forschungszwecken informiert und hatten das Recht, die Teilnahme zu verweigern.

Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze sind im Mendeley-Repository (https://data.mendeley.com) (https://doi.org/10.17632/gc9g2g53kr.1) verfügbar.

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JPE-D ist Postdoktorand am National Institute of Genomic Medicine und erhielt ein Stipendium von CONAHCyT im Programm „Postdoctoral Stays in Mexico in Support of SARS CoV2 (COVID-19, 2166969)“.

CONACyT-Fördernummer 311880 „Identifizierung und Validierung von immunmetabolischen Markern, die die Anfälligkeit für die Entwicklung schwerer Formen einer SARS-CoV-2-Infektion erhöhen.“ CONACyT-Fördernummer 319503 „Massives Screening kleiner Moleküle zur Identifizierung von Biomarkern und therapeutischen Kandidaten mit hohem Wirksamkeitspotenzial gegen weltweit zirkulierende neue Varianten von SARS-CoV-2.“ Christus Muguerza vom Parque Hospital, Chihuahua, Mexiko. Mexikanisches Institut für soziale Sicherheit. Genome Alberta (eine Abteilung von Genome Canada) Fördernummer TMIC MC4, Fördernummer FS 148461 der Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Fördernummer MSIF 35456 der Canada Foundation for Innovation (CFI).

CONAHCyT-Labor für Metabolomik und Proteomik, Akademische Abteilung für Biowissenschaften, Autonome Universität Zacatecas, 98000, Zacatecas, Mexiko

Yamilé López-Hernández

Abteilung für Gesundheitsforschung, Krankenhaus Christus Muguerza del Parque – Universität Monterrey, 31125, Chihuahua, Mexiko

Joel Monárrez-Espino

Akademische Abteilung für Biowissenschaften, Autonome Universität Zacatecas, 98000, Zacatecas, Mexiko

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Jesus Adrian Lopez

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Studienkonzept und -design: YLH und JMEJCB sowie DAGL rekrutierten Studienteilnehmer und sammelten Proben. Datenerfassung: JZ, JPED, RM und EMM Statistische Analyse: MB, RM Dateninterpretation: YLH, MB, JME, JAL, DSW Verfassen des Manuskripts: YLH Manuskriptbearbeitung: CTCDSW überwachte die gesamte Forschung und überarbeitete das Originalmanuskript. Alle Autoren beteiligten sich an der Diskussion und stimmten der endgültigen Fassung des Manuskripts zu.

Korrespondenz mit Yamilé López-Hernández oder David S. Wishart.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

López-Hernández, Y., Monárrez-Espino, J., López, DAG et al. Das Plasmametabolom von Long-COVID-Patienten zwei Jahre nach der Infektion. Sci Rep 13, 12420 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39049-x

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Eingegangen: 19. Mai 2023

Angenommen: 19. Juli 2023

Veröffentlicht: 01. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39049-x

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