Präklinische Sicherheit und biologische Verteilung von CRISPR gegen SIV bei nicht

Gentherapie (2023)Diesen Artikel zitieren

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In dieser Studie demonstrieren wir die Sicherheit und den Nutzen der CRISPR-Cas9-Genbearbeitungstechnologie für die In-vivo-Bearbeitung proviraler DNA in ART-behandelten, viral kontrollierten, mit dem Simian Immunodeficiency Virus (SIV) infizierten Rhesusaffen, einem etablierten Modell für HIV-Infektionen. EBT-001 ist ein AAV9-basierter Vektor, der SaCas9 und Dual-Guide-RNAs liefert und auf mehrere Regionen des SIV-Genoms abzielt: die viralen LTRs und das Gag-Gen. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass eine einzelne IV-Inokulation von EBT-001 in jeder der drei Dosisstufen (1,4 × 1012, 1,4 × 1013 und 1,4 × 1014 Genomkopien/kg) zu einer breiten und funktionellen Bioverteilung von AAV9-EBT-001 führte bekannte Gewebereservoirs von SIV. Es wurden keine Nebenwirkungen oder abnormale Pathologien beobachtet und die Tiere kehrten nach der Verabreichung von EBT-001 zu ihrem normalen Körpergewicht zurück. Wichtig ist, dass die Makaken, die die zwei höchsten Dosen von EBT-001 erhielten, im Vergleich zu antiretroviral behandelten Kontrollen verbesserte absolute Lymphozytenzahlen zeigten. Zusammengenommen belegen diese Ergebnisse Sicherheit, Bioverteilung und in vivo provirale DNA-Bearbeitung nach intravenöser Verabreichung von EBT-001 und unterstützen die Weiterentwicklung der CRISPR-basierten Genbearbeitung als potenziellen therapeutischen Ansatz für HIV beim Menschen.

Nichtmenschliche Primaten (NHPs) werden seit Beginn der HIV-Pandemie verwendet, um lentivirale Infektionen, Pathobiologie und Pathogenese zu verstehen und die klinische Wirksamkeit vorherzusagen, und kürzlich auch zur Bewertung von Eradikationsstrategien und innovativen Ansätzen zur Heilung von HIV [1,2,3] . In den hier vorgestellten Studien verwendeten wir mit dem Simian Immunodeficiency Virus (SIV) infizierte, antiretroviral (ART) behandelte Indische Rhesusaffen, um die Bioverteilung, Sicherheit und die Fähigkeit der CRISPR/Cas9-Geneditierungsbehandlung (EBT-001) zur integrierten Zielsetzung zu bewerten SIV wird als einzelne intravenöse (IV) Bolusinfusion verabreicht [4]. EBT-001 (kodiert SIV-Targeting-Guide-RNAs) ist das Affenhomolog von EBT-101 (kodiert HIV-Targeting-Guide-RNAs) und besteht aus einem in einem Adeno-assoziierten Virus des Serotyps 9 (AAV9) eingekapselten All-in-One-CRISPR-Konstrukt, das gleichzeitig das exprimiert SaCas9-Endonuklease und Dual-Guide-RNAs (gRNAs), die auf die viralen Long Terminal Repeats (LTRs) und das Gag-Gen abzielen. EBT-101 ist für die Entfernung großer dazwischenliegender integrierter proviraler SIV-DNA-Sequenzen konzipiert, die zwischen den beabsichtigten CRISPR-Zielstellen positioniert sind, wodurch drei mögliche Deletionen erzeugt werden: 5'LTR zu Gag, Gag zu 3'LTR und 5'LTR zu 3'LTR . Die Verwendung der AAV9-Abgabe wird durch unsere ersten Studien in kleinen und großen Tiermodellen gestützt, zusätzlich zu einer Vielzahl von Beweisen aus früheren klinischen Studien zur Gentherapie, in denen AAV9 Sicherheit, Wirksamkeit und breite Bioverteilungseigenschaften gezeigt hat [4,5,6] . Hier präsentieren wir umfassendere Daten zur Sicherheit, einschließlich umfangreicher Off-Target-Analysen und Bioverteilung mehrerer Dosen (1012, 1013, 1014 GC/kg) von EBT-001 sowie einer erweiterten Studie (3 und 6 Monate) an einem indischen Rhesusaffen SIV-Modell. Diese präklinische Studie zur Sicherheit, Bioverteilung und Wirksamkeit zeigte, dass eine einzelne intravenöse Verabreichung von EBT-001 zur SIV-Bearbeitung gut verträglich war und Virusreservoirs in NHPs weitgehend erreichen und entfernen kann, ohne dass Nebenwirkungen außerhalb des Ziels beobachtet wurden. Diese Ergebnisse belegen, dass eine einzige intravenöse Inokulation von EBT-101 zur Bearbeitung von HIV-Genen genutzt werden kann, um Virusreservoirs in infizierten Geweben im ganzen Körper zu erreichen und so die sichere und spezifische In-vivo-Bearbeitung latenter HIV-Provirus-DNA zu ermöglichen.

Diese Studie wurde vom IACUC von BIOQUAL, Protokollnummer 18-036, genehmigt. Zwölf männliche indische Rhesusaffen (Macaca mulatta) wurden vom Caribbean Primate Research Center in Puerto Rico erhalten. Es wurden zwei Studien durchgeführt. Die erste war ein n = 10 mit Tieren, die von einem Statistiker in vier Behandlungsgruppen randomisiert wurden: 3 unbehandelt, 3 mit 1,4 × 1012 GC/kg EBT-001 behandelt und 4 mit 1,4 × 1013 GC/kg EBT-001 behandelt (2 wurden obduziert). 3 Monate und 2 6 Monate nach EBT-001). Die Randomisierung erfolgte mithilfe einer permutierten Block-Randomisierungsmethode mit der Einschränkung, dass sich Tiere, die mit Sozialpartnern gepaart waren, in derselben Gruppe befanden. In der zweiten Studie wurde mit n = 2 eine um 1 Log höhere EBT-001-Dosis von 1,4 × 1014 GC/kg verwendet und hier wurde keine Randomisierung durchgeführt. Alle Tiere wurden gescreent und waren dreifach negativ für Mamu-A*01, Mamu-B*08 und Mamu-B*17. Alle Rhesusaffen wurden in der Piccard Drive Facility von BIOQUAL in Rockville, MD, empfangen, wo alle hier beschriebenen In-vivo-Studien durchgeführt wurden. Die Rhesusaffen wurden vor der Studie serologisch auf Retroviren (STLV und SIV), SA8-Virus, SHF-Virus und Masernvirus untersucht. Die Tiere wurden mit SIVmac239 (ein Geschenk von Dr. Preston Marx, Tulane Primate Center) infiziert. Den Tieren wurde eine tägliche ART-Therapie mit Tenofovir (TDF; #T018500; 15 mg/kg/Tier), Emtricitabin (FTC; #E525000; 50 mg/kg/Tier) und Dolutegravir (DTG; #D528800; 2,5 mg/Tier) verabreicht. kg/Tier) (Toronto Research Chemicals) beginnend am 28. Tag nach der Infektion und fuhr mit der Autopsie fort. Die Tiere wurden auf Morbidität, Mortalität, Verletzung und Verfügbarkeit von Futter und Wasser untersucht. Alle Tiere mit schlechtem Gesundheitszustand wurden zur weiteren Überwachung, klinischen Behandlung und möglichen Euthanasie identifiziert. Zu den Beobachtungen gehörten unter anderem die Beurteilung von Haut, Fell, Augen, Ohren, Nase, Mundhöhle, Brustkorb, Bauch, äußeren Genitalien, Gliedmaßen und Füßen, Auswirkungen auf die Atmung und den Kreislauf, autonome Auswirkungen wie Speichelfluss und Auswirkungen auf das Nervensystem einschließlich Zittern, Krämpfe, Reaktionsfähigkeit bei der Handhabung, neurologische/verhaltensbezogene Auswirkungen und ungewöhnliches Verhalten. Die SIV-Viruslast (Nachweisgrenze 50 Kopien/ml) wurde im Verlauf der Infektion in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Plasma gemessen (Ergänzendes Material und Methoden). Während des Studienzeitraums wurde an mehreren Tagen Vollblut gesammelt und zur vollständigen Blutbildanalyse (CBC) und Blutchemie an IDEXX BioAnalytics, Inc. übermittelt. Den Tieren wurde EBT-001 6 Monate nach der SIV-Infektion mit einer langsamen intravenösen Infusion mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min verabreicht. Die zu dosierende Menge des EBT-001-Vektors wurde zu insgesamt 100 ml 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für jedes Tier hinzugefügt, basierend auf dem aktuellen Körpergewicht und der aktuellen Dosis (Tabelle S2). Die Tiere wurden entweder 3 Monate oder 6 Monate nach der EBT-001-Infusion einer vollständigen Autopsie unterzogen (ergänzendes Material und Methoden). Bei BioQual wurde keine Verblindung hinsichtlich Tiergruppen vorgenommen.

Diese Informationen finden Sie im Ergänzenden Material und Methoden (Ergänzendes Material und Methoden und Abb. S1–S4).

Ein TaqMan-basierter qPCR-Assay wurde verwendet, um EBT-001-(Vektor-)DNA in Geweben (Charles River) und im Blut im Zeitverlauf zu quantifizieren (ergänzendes Material und Methoden).

Wir verwendeten zwei verschachtelte PCR-Assays (5 G EXA und G3 EXA), um die verschiedenen Exzisionsamplikons/Produkte in inneren Organ- und Gewebeproben nachzuweisen, die von Makaken erhalten wurden, die mit dem Gentherapieprodukt EBT-001 (SIV AAV9 CRISPR/Cas9) behandelt wurden (Ergänzungsmaterial und). Methoden). Eine Schätzung der Bearbeitung wurde nur für die 5-G-Produkte berechnet (Ergänzungsergebnisse, Tabellen S8 und S9 sowie Abb. S6). Das Forschungspersonal war während der Exzisionstests und -analysen hinsichtlich der Tiergruppen blind.

EDTA-Plasmaproben wurden mit dem Mesoscale Discovery (MSD)-Assay analysiert. Jede Vertiefung der Platte ist eine Arbeitselektrodenoberfläche, die das Einfangreagenz absorbiert. Das Zytokin-Panel 1 (NHP, MSD v-plex K15057D) und das Proinflammatorische Panel 1 (NHP, MSD-Kit #K15056D) wurden in der Studie verwendet und speziell für NHPs validiert. Zunächst wurden die Platten dreimal gewaschen und 2 Stunden lang unter Schütteln mit Kalibratoren/Proben inkubiert. Anschließend wurden die Platten gewaschen und 2 Stunden lang mit dem Detektionsantikörpercocktail inkubiert. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Platten gelesen und die Daten mit der MSD-Software analysiert.

Kontinuierliche Messungen wurden durch Streudiagramme dargestellt und als Mittelwert ± Standardaufwand des Mittelwerts zusammengefasst. Bezüglich des Affengewichts wurde Gruppe 1 (unbehandelt) mit den Gruppen 2, 3 und 4 kombiniert (behandelt) verglichen. Ein lineares Mixed-Effects-Modell wurde verwendet, um die prozentuale Gewichtsveränderung gegenüber der Zeit vor EBT-001 zwischen behandelten und unbehandelten Gruppen im Laufe der Zeit zu vergleichen. Die statistische Signifikanz basierte auf einem zweiseitigen Alpha-Wert von weniger als 0,05. Die Varianz war zwischen den Gruppen ähnlich und die Daten sind normalverteilt.

Die Nominierung von Off-Target-Editing-Sites erfolgte mithilfe einer proprietären COTANA-Pipeline, die auf dem Open-Source-Tool Cas-OFFinder v2.4.1 (https://github.com/snugel/cas-offinder/) basiert und ähnliche Suchergebnisse liefert [ 7]. Die ausgegebenen chromosomalen Stellen wurden lokal neu ausgerichtet und mit dem Nuclease-Off-Target-Tool v3.0.0 (https://github.com/eli88fine/nuclease-off-target) bewertet, wobei die in Tabelle S1 gezeigte Bewertungsmatrix für Strafen-Match-Scores verwendet wurde. Für die WGS-Analyse wurde HIVE (https://hive.aws.biochemistry.gwu.edu/dna.cgi?cmd=main) verwendet [8, 9].

CRISPR-gRNA-Designertools wurden verwendet, um gRNAs zu identifizieren, die auf LTR und Gag abzielen, wobei die Wahrscheinlichkeit unbeabsichtigter Auswirkungen für die zuvor beschriebenen HIV-gerichteten Leitfäden minimal ist [6, 10]. Frühere Untersuchungen zeigten Wirksamkeit bei der Bekämpfung von HIV in Kulturen und unter Verwendung eines infizierten humanisierten Mausmodells mit Leit-RNAs, die auf LTR-1 und GagD abzielen [6]. Für diese Arbeit an Rhesusaffen wurden gRNAs, die auf SIV abzielen, ausgewählt, um dieselben Regionen wie die HIV-Leitfäden für diese Bioverteilungs- und Sicherheitsstudien darzustellen.

Das Bioinformatik-Tool COTANA (CRISPR Off-Target Nomination & Analysis) durchsuchte das Rhesusaffen-Referenzgenom (NCBI-Genomassemblierung Mmul_10) umfassend nach den chromosomalen Sequenzen, die der Zielstelle am ähnlichsten sind. COTANA gibt jede nominierte Stelle mit der angegebenen Anzahl an Unterschieden zwischen der gRNA- und DNA-Sequenz aus (Tabelle 1). Die Ausgabe für die umfassende Suche, einschließlich Nichtübereinstimmungen und möglicher Ausbuchtungen, enthält wenige nominierte Stellen im Rhesusaffen-Genom und sehr wenige mit weniger als 4 Unterschieden (Ergänzende Materialien und Methoden). In der Liste der Ausgabe-Sites gibt es auch einige mit niedrigen Penalty-Match-Scores, was im Allgemeinen auf eine größere Wahrscheinlichkeit hindeutet, sequenzverifizierte Off-Target-Sites zu finden. Die Penalty-Match-Scores wurden auf der Grundlage der zunehmenden Anzahl, Art und Lage der Fehlpaarungen und Ausbuchtungen zwischen der gRNA und der chromosomalen Sequenz berechnet (Abb. 1). Beim Einsatz der Genbearbeitung zur Korrektur krankheitsverursachender Mutationen ist man im Allgemeinen auf die wenigen Zielstellen beschränkt, die am nächsten sind. Bei der gezielten Inaktivierung viraler Sequenzen besteht eine viel größere Flexibilität, da mehrere Targeting-Strategien und Serien von Zielstellen bioinformatisch gescannt werden können, um konservierte virale Zielstellen auszuwählen, die eine viel geringere Anzahl und Ähnlichkeit der chromosomalen Positionen aufweisen [11,12,13]. Diese gRNAs geben viel weniger Stellen aus als gRNAs, die auf kodierende Sequenzen abzielen, wie in früheren Veröffentlichungen und bei der Untersuchung von EBT-101 gezeigt wurde [11, 12].

Alle Stellen in der bioinformatischen Ausgabe der Rhesusaffen-Genomsuche mit SIV-Guide LTR, der drei Unterschiede zulässt, und Gag, der vier Unterschiede zulässt, werden aufgelistet. Der Leitfaden (farbig) und die PAM-Sequenz (grau) sind oben aufgeführt, die chromosomale Sequenz unten mit den Positionen und der Identität der Fehlpaarungen in Kästchen. Die beiden Arten von Ausbuchtungen werden ebenfalls angezeigt. Lücken in der chromosomalen DNA relativ zur Guide-RNA werden in roten Kästchen mit Strichen angezeigt. Zusätzliche Nukleotide in der chromosomalen DNA im Vergleich zum Leitfaden werden in roten Dreiecken angezeigt. Die Anzahl der Fehlpaarungen und Ausbuchtungen sowie der Übereinstimmungswert für jede Chromosomenposition werden in der rechten Spalte aufgeführt. Es wurden keine Loci ohne Fehlpaarungen in den proximalen 8 Nukleotiden identifiziert, wo Unterschiede weniger toleriert werden (rot umrandet). Darüber hinaus weist keiner der nominierten Off-Target-Loci einen Strafspielwert von weniger als 2 auf (rechte Spalte). Bp-Basenpaar, chr-Chromosom, lange terminale LTR-Wiederholungen, MM-Fehlpaarung, PAM-Protospacer-benachbartes Motiv, SIV-Affenimmundefizienzvirus.

In zwei passenden Studien wurden SIV-infizierte und antiretroviral behandelte NHP als Großtiermodell verwendet, um die Fähigkeit von AAV9-verabreichtem EBT-001 zu testen, integrierte SIV-DNA zu entfernen. In Studie eins wurden insgesamt 10 männliche Rhesusaffen (Macaca mulatta) in drei Gruppen eingeteilt: Gruppe 1 erhielt keine EBT-001-Behandlung, Gruppe 2 mit 1,4 × 1012 Genomkopien (GC)/kg EBT-001 und Gruppe 3 mit 1,4 × 1013 GC/kg EBT-001 (Abb. 2A). In Studie zwei wurde 2 Tieren in Gruppe 4 eine höhere Dosis (1,4 × 1014 GC/kg) EBT-001 verabreicht (Abb. 2B). In beiden Studien wurden NHPs untersucht, die mit SIVmac239 (200 TCID50) über den iv-Weg infiziert und mit einem dreifachen ART-Regime (Tenofovir (TDF), Emtricitabin (FTC) und DTG) über den sq-Weg behandelt wurden (Abb. 2C). Dieses Regime wurde aufgrund seiner Ähnlichkeit mit der Behandlung HIV-infizierter Menschen zur Kontrolle einer HIV-Infektion ausgewählt. ART begann 28 Tage nach der Infektion und alle 12 Tiere blieben während des gesamten Studienverlaufs auf ART. Sobald die Viruskonzentration im Blut auf ein Minimum reduziert war, wurden die Tiere nur mit ART (Gruppe 1) behandelt oder mit einer von drei Dosen EBT-001 behandelt, die durch eine einzelne intravenöse Infusion verabreicht wurden (Abb. 3C, Ergänzende Materialien und Methoden, Tabelle S2). Alle Affen erhielten die volle Dosis EBT-001. Bei einem Affen (CK49) in Gruppe 3 kam es nach Verabreichung einer Anästhesie zu Kurzatmigkeit und Hypoxie, die sich nach der Infusion von EBT-001 verschlimmerte. Die Infusion von EBT-001 wurde unterbrochen, während der Affe wegen eines akuten Lungenödems behandelt wurde und sich erholte. Die verbleibende Dosis EBT-001 wurde mehrere Tage später ohne Komplikationen verabreicht. Dies war eine Nebenwirkung des Anästhetikums Dexdomitor, da die erneute Gabe von EBT-001 gut vertragen wurde und die Symptome mit den Nebenwirkungen von Dexdomitor übereinstimmten. Ein Tier in Gruppe 2 entwickelte nach der EBT-001-Infusion einen Hautausschlag. Die virale Plasma-RNA wurde während des gesamten Infektionsverlaufs und nach EBT-001 gemessen (Abb. 2D, E).

Ursprüngliches Studiendesign n = 10 (A), Folgestudiendesign n = 2 (B), Studiendiagramm mit identifizierten Gruppen 1–4 (C), individuelle Plasmaviruslasten (log10 Kopien/ml Plasma) (D) und Mittelwert und SEM der Plasmaviruslasten von 4 Gruppen (E). Schwarz ist unbehandelte Gruppe 1; Rot ist Gruppe 2, 1012 GC/kg; Hellblau ist Gruppe 3, 1013 GC/kg; Dunkelblau ist Gruppe 4, 1014 GC/kg. Mittelwert und SEM werden für die Gruppe an den Tagen nach der Infektion angezeigt. Antiretrovirale ART-Therapie, CHOP Children's Hospital of Philadelphia, GC-Genomkopien, IV intravenös, SIV Simian Immunodeficiency Virus, sq subkutan, TCID50 mittlere infektiöse Gewebekulturdosis, UNC University of North Carolina.

Bioverteilung der EBT-001-Vektor-DNA als log10 Kopien der EBT-001-DNA pro µg Affen-gDNA in wichtigen Gewebereservoirs von HIV (A) und anderen Geweben, einschließlich verschiedener Gehirnregionen (B). Symbole stellen einzelne Tiere dar und Mittelwert und SEM werden angezeigt. gDNA, genomische DNA; SEM, Standardfehler des Mittelwerts. Drei unbehandelte Tiere erhielten kein EBT-001, wurden aber gleichzeitig mit den drei Monate lang mit EBT-001 behandelten Tieren obduziert. ND nicht bestimmt.

Plasmaproben wurden vor der Studie und bei der Autopsie auf neutralisierende Antikörper gegen AAV9 untersucht (Tabelle S4). Die Behandlung mit EBT-001 war 3 oder 6 Monate nach der Behandlung im Vergleich zu den Werten vor der Dosis mit einem Anstieg der neutralisierenden AAV9-Antikörper verbunden. Die Titer vor der Dosis (Werte der reziproken Serumverdünnung) waren niedrig (< 5 und 80), mit Ausnahme von CF63, das einen Titer vor der Dosis von 320 aufwies. Die Werte bei der Autopsie lagen bei mit EBT-001 behandelten Tieren zwischen 80 und 5120 und waren es auch am höchsten bei den Affen, die 6 Monate nach EBT-001 getötet wurden. Bemerkenswert ist, dass sich der CF63-Titer nach der EBT-001-Behandlung nicht veränderte, obwohl er zu Studienbeginn am höchsten war.

Alle Affen überlebten bis zur geplanten Euthanasie (3 oder 6 Monate nach EBT-001), als bei allen Tieren eine vollständige Autopsie durchgeführt wurde (Ergänzungsmaterial und Methoden). Insgesamt lagen die Beobachtungen der groben Autopsie im normalen Bereich, mit Ausnahme eines einzelnen Tieres (1T6, Gruppe 1) aus der nur ART-behandelten Gruppe, das dehydriert war und einen dünnen Körperzustand aufwies (2/5 Körperzusammensetzungswert). Alle Befunde stimmten mit einer SIV-Infektion überein (Tabelle S5). Bei einer umfassenden histopathologischen Untersuchung wichtiger Organe durch Charles River Laboratories, LLC wurden keine EBT-001-bezogenen makroskopischen oder mikroskopischen pathologischen Befunde festgestellt. Allgemeine mikroskopische Befunde, die auf eine chronische SIV-Infektion zurückzuführen sind, wurden in allen Behandlungsgruppen beobachtet und umfassten minimale bis leichte lymphoide Hyperplasie der Keimzentren und der Mantelzone des mesenterialen Lymphknotens, lymphoide Hyperplasie der sekundären Lymphfollikel in der weißen Pulpa der Milz mononukleäre Zellinfiltration von Herz, Niere und Lunge. Darüber hinaus kam es bei Tier BM79 (Gruppe 4) zu einer lymphoiden Hyperplasie der periarteriolären Lymphscheiden der Milz. Es gab keine offensichtlichen Unterschiede in der Häufigkeit oder Schwere dieser Befunde bei Affen, die nur mit ART behandelt wurden, oder bei Affen, die mit ART in Kombination mit EBT-001 behandelt wurden. In einer separaten neuropathologischen Untersuchung, die von Experimental Pathology Laboratories, Inc. durchgeführt wurde, waren die Befunde bei allen SIV-infizierten Rhesusaffen gering und bestanden hauptsächlich aus fokalen minimalen Befunden von Mikrogliose und seltener Astrozytose und/oder spärlichen perivaskulären mononukleären Zellinfiltraten. Insgesamt stimmten die mikroskopischen Befunde mit einer chronischen SIV-Infektion überein und wurden mit ähnlicher Häufigkeit bei Kontroll-SIV-infizierten Tieren beobachtet, die zu denselben Zeitpunkten aus einer anderen EBT-001-Studie untersucht wurden. Die Ergebnisse wurden daher nicht auf die Behandlung mit EBT-001 zurückgeführt.

Um die Bioverteilung des Vektors in Geweben bei der Autopsie zu beurteilen, wurde ein TaqMan-basierter qPCR-Assay zur Quantifizierung der EBT-001-(Vektor-)DNA (Charles River) verwendet (Abb. 3A, B). Alle von den unbehandelten Tieren (Gruppe 1) gesammelten DNA-Bioverteilungs- und Vektorausscheidungsproben waren negativ, was zeigt, dass die Kontamination in dieser Studie durch Tierdosierung, Autopsie, DNA-Extraktion und qPCR-Analyse gut kontrolliert wurde. Gewebe, die als wichtige HIV/SIV-Reservoirs gelten, einschließlich Milz, Lymphknoten, Dickdarm, Knochenmarkskompartiment und Blut, wurden auf Vektorbioverteilung untersucht (Abb. 3A). Die Konzentrationen der Vektor-DNA in der Milz lagen zwischen 4,82 und 6,44 (log10 Kopien der EBT-001-DNA/µg Affen-DNA). Für die mesenterialen Lymphknoten lag der Wert zwischen 4,01 und 6,42 und für den Dickdarm zwischen 2,52 und 4,24 (log10 Kopien der EBT-001-DNA/µg Affen-DNA). Im Knochenmark war die Vektor-DNA in Gruppe 2 nicht nachweisbar, in Gruppe 3 bei 1,75–3,55 (log10 Kopien von EBT-001-DNA/µg Affen-DNA) und in Gruppe 4 mit durchschnittlich 5,5 (log10 Kopien von EBT-001) um 2 Logs höher DNA/µg Affen-DNA). Im Blut, wo sich die Zellen schnell umwandeln, wurde Vektor-DNA nur bei den beiden Tieren aus Gruppe 3 gefunden, die 3 Monate nach EBT-001 obduziert wurden, und fehlte bei Tieren derselben Gruppe, die bei 6 Monaten und darüber hinaus obduziert wurden Das behandelte Tier wurde ebenfalls nach 6 Monaten getötet (Gruppe 4) (Abb. 3A). Als jedoch die Bioverteilung im Blut ab zwei Wochen nach EBT-001 seriell untersucht wurde, wurde in den Gruppen 2 und 3 Vektor-DNA nachgewiesen, die mit der Zeit abnahm (Abbildung S5). Die höchste Konzentration an EBT-001-DNA wurde in den Leberproben der Gruppen 3 und 4 nachgewiesen (Abb. 3B). Beim Gehirn und anderen Geweben war die Konzentration in Gruppe 2 niedrig oder nicht nachweisbar und die Verteilung war in Gruppe 3 erhöht, aber interessanterweise lagen die Konzentrationen in Gruppe 4 im Bereich von 4 (log10 Kopien der EBT-001-DNA/µg Affen-DNA). Es wurden keine Hinweise auf eine Vektorausscheidung im Stuhl oder Urin beobachtet (nicht gezeigt). Die qPCR-Ergebnisse bestätigen, dass EBT-001 bei Tieren, denen der Vektor verabreicht wurde, weit verbreitet im Blut und in allen wichtigen Organen und Geweben verteilt war. Die Bioverteilung von EBT-001 (DNA-Spiegel) war dosisabhängig und die Vektorspiegel in jedem Gewebe und Blut nahmen mit der Zeit ab, blieben jedoch in vielen Geweben 6 Monate nach der Injektion bestehen.

Die SIV-Exzisionsaktivität wurde über alle Behandlungsgruppen und Gewebe hinweg getestet. Die 2 gRNAs in EBT-001 zielen auf 3 Stellen im SIV ab und schneiden daher 3 große dazwischenliegende integrierte provirale SIV-Segmente aus. Die LTR-gRNA schneidet sowohl den 5′- als auch den 3′-LTR. Da dieser Leitfaden zusammen mit der Gag-gRNA geliefert wird, besteht die Möglichkeit, dass die dazwischenliegende integrierte provirale SIV-DNA-Sequenz zwischen 5'LTR zu Gag, Gag zu 3'LTR und zwischen 5'LTR und 3'LTR entfernt wird . Zwei Tests wurden verwendet, um die Exzision von 5'LTR zu Gag (5G) und Gag zu 3'LTR (G3) in Geweben und Blut nachzuweisen (siehe ergänzende Materialien und Methoden sowie ergänzende Tabelle 3). Hinweise auf eine Exzision wurden durch die Beobachtung verschachtelter PCR-Produkte verschiedener DNA-Fragmente von 268 oder 171 bp nachgewiesen, die aus der Entfernung dazwischenliegender DNA-Sequenzen zwischen 5'LTR bis Gag (5G) bzw. Gag bis 3'LTR (G3) resultierten ( Abb. 4A, C). Der 5-G-Assay amplifizierte auch das SIV in voller Länge bei einer Amplikongröße von 1282 bp. Aufgrund der umfangreichen Homologie zwischen den 5′- und 3′-LTR-Sequenzen und dem Fehlen standardisierter flankierender Sequenzen aufgrund der zufälligen chromosomalen Integration der proviralen SIV-DNA war es nicht möglich, das dritte Exzisionsprodukt zu messen, das das gesamte 5′-LTR zu 3 entfernt ′LTR-Anteil. Beide PCR-basierten Exzisionstests (5G und G3) wurden (in zweifacher Ausfertigung von zwei Bedienern) für Blut und kleine Gewebe- und Organschnitte durchgeführt, darunter: Knochenmark, Gehirn (Hirnstamm, Kleinhirn, Frontalhirn, Hinterhaupthirn, Parietal, Präfrontal, Schläfenrinde), Dickdarm, Zwölffingerdarm, Herz (linker Ventrikel, linker Vorhof, rechter Ventrikel, rechter Vorhof), Nieren, Leber, Lunge, mesenteriale Lymphknoten, Milz und Hoden (Abb. 4, Tabellen S6 und S7). Die 5G- und G3-Daten sind in Tabelle S6 für Gewebe und Tabelle S7 für Blut zusammengefasst. In Abb. 4B für Gewebe und Abb. 4D für serielle Blutentnahmen wird die positive Exzision, definiert durch den Nachweis des verschachtelten PCR-Produkts verschiedener DNA-Fragmente von 268 bp (5G) oder 171 bp (G3) oder beidem, durch a dargestellt Flugschreiber. Keine Exzision, definiert durch den fehlenden Nachweis eines der verschachtelten PCR-Produkte von 268 bp (5G) oder 171 bp (G3), wird durch ein graues Kästchen dargestellt. Wenn kein Produkt in voller Länge (oberes Band von 1282 bp nur in 5G) oder ausgeschnittenes Produkt amplifiziert werden konnte (sowohl in 5G als auch in G3), wird dies durch ein weißes Kästchen dargestellt. Diese Analyse zeigte die SIV-DNA-Spaltung in einem breiten Spektrum von Geweben, 3 und 6 Monate nach der Vektorbehandlung. Bei allen mit EBT-001 behandelten Tieren wurde in einigen Geweben eine SIV-Virusexzision, 5'LTR zu Gag oder Gag zu 3'LTR, beobachtet. Es wurden Unterschiede bei den einzelnen Tieren sowie Unterschiede bei der Exzision von Geweben beobachtet. Eine Exzision wurde nach 3 Monaten und in einigen Geweben nach 6 Monaten festgestellt. In einigen Gewebeproben wurde bei der höchsten EBT-001-Dosis (Gruppe 4) 6 Monate nach EBT-001 kein Virus nachgewiesen, was auf die Eliminierung viraler DNA aus diesen Gewebeabschnitten hinweisen könnte. Die Ergebnisse der Exzisionsaktivitätsanalyse zeigten eine SIV-DNA-Spaltung in einem breiten Spektrum von Geweben 3 und 6 Monate nach der Vektorbehandlung und im Blut 2–10 Wochen nach der Vektorbehandlung, einschließlich des Vorhandenseins einer SIV-Exzision im Blut eines Tieres (BM79). ) bei der Autopsie (Abb. 4D). Da der 5G EXA-Assay sowohl das Virus voller Länge (1282 bp) als auch das Amplifikat (268 bp) des Exzisionsprodukts nach der Entfernung dazwischenliegender DNA-Sequenzen zwischen 5′LTR und Gag amplifiziert, haben wir die prozentuale Effizienz der 5G-Exzision berechnet (Tabellen S8 und S9, Abb. S6, Ergänzende Materialien und Methoden). Wir verstehen die Grenzen dieses PCR-basierten Tests, da er halbquantitativ ist und es möglich ist, dass die kleineren Exzisionsprodukte effizienter amplifiziert werden als das intakte Virus. Darüber hinaus spiegelt dieser Test nur eines von drei möglichen Exzisionsprodukten wider, die beim EBT-001-Schneiden entstehen können. Trotz der Einschränkungen der Assay-Detektion zeigen die Ergebnisse unterschiedliche Exzisionsfähigkeiten, wobei bei mehreren Tieren berichtet wurde, dass sie selbst bei niedrigeren Dosen eine nachweisbare Exzision in den untersuchten Gewebeschnitten aufwiesen.

Beispiel einer 5G- und G3-PCR von Nekropsiegeweben des Affen MA285 (A). Vorliegen einer viralen Exzision (dargestellt als schwarze Kästchen), Fehlen einer viralen Exzision (graue Kästchen) oder Fehlen von vollständigem und herausgeschnittenem Produkt (weiße Kästchen) in mehreren Geweben bei der Autopsie (B). Beispiel einer 5G- und G3-PCR aus dem Blut der Tiere BM79 und CP26 vor EBT-001 und 4, 5 und 6 Monate nach EBT-001 (C). Vorliegen einer viralen Exzision (schwarzes Kästchen) oder Fehlen einer viralen Exzision (graue Kästchen) aus dem Blut von Tieren nach EBT-001 (D). Die gepunktete Linie stellt den Autopsiezeitpunkt von 3 Monaten oder 6 Monaten dar. Aufgrund des COVID-Shutdowns wurde den Tieren mit 1014 GC/kg 0,5–3,0 Monate nach EBT-001 kein Blut entnommen. GC-Genomzahlen, mes ln mesenterialer Lymphknoten, PCR-Polymerase-Kettenreaktion, SIV-Affenimmundefizienzvirus.

Im Verlauf der Studie wurde bei jedem Affen das Gewicht (kg) gemessen. Wir beobachteten, dass die Tiere der Gruppe 1 (unbehandelt, auf ART gehalten) während der Studie weiterhin Gewicht verloren, wohingegen die mit EBT-001 behandelten Gruppen ihren Gewichtszunahmepfad beibehielten, wie es für ihre normale Gruppe zu erwarten ist (behandelt vs. unbehandelt, P = 0,029). ), wobei die Tiere mit der höchsten Dosis die größten Gewichtszunahmen aufwiesen (Abb. 5A). In der Kohorte, die die höchste EBT-001-Dosis erhielt, erlitt keines der Tiere einen Gewichtsverlust und bei beiden kam es zu einem Anstieg der absoluten Lymphozytenzahl (Abb. 5B), ohne dass es zu einem Anstieg der Monozyten kam (Abb. 5C). Beim Vergleich vor der Infektion, vor EBT-001 und 3 Monate nach EBT-001 wurden bei mit EBT-001 behandelten Tieren keine Veränderungen bei Cholesterin, Glukose, Phosphor, Kalzium, Globin und Gesamtprotein beobachtet (Abb. 5D–I). . Allerdings litt das nur mit ART behandelte Tier, IT6, an schwerer Leukopenie (Abb. 5B), mittelschwerer Hypophosphatämie (Abb. 5F), mittelschwerer Hypokalzämie (Abb. 5G), schwerer Anämie und Hypoproteinämie (Abb. 5H, I). Darüber hinaus wies das unbehandelte Tier 7S0 eine ausgeprägte Hypoglykämie auf (Abb. 5E).

Der Mittelwert (SEM) der Tiergewichte wird als prozentuale Veränderung des Gewichts vor EBT-001 angezeigt. Die Gewichte von mit EBT-001 behandelten Linien (rote, hellblaue und dunkelblaue Linien) sind im Vergleich zu unbehandelten Linien (schwarz) signifikant erhöht (P = 0,029). Ein lineares Mixed-Effects-Modell wurde verwendet, um die prozentuale Gewichtsveränderung gegenüber der Zeit vor EBT-001 zwischen behandelten und unbehandelten Gruppen im Laufe der Zeit zu vergleichen. Die statistische Signifikanz basierte auf einem zweiseitigen Alpha-Wert von weniger als 0,05 (A). Dargestellt ist die fache Veränderung der Lymphozytenzahl aus den CBC-Daten gegenüber den durchschnittlichen Werten vor EBT-001. Jedes Symbol stellt ein Tier dar und wird als Mittelwert und SEM (B) angezeigt. Dargestellt ist die fache Änderung der Monozytenzahl aus den CBC-Daten gegenüber den durchschnittlichen Werten vor EBT-001. Jedes Symbol stellt ein Tier dar und wird als Mittelwert und SEM (C) angezeigt. Die Streupunktdiagramme zeigen den Mittelwert und die SEM, wobei jedes Symbol ein Tier vor der Infektion, vor EBT-001 und 3 Monate nach EBT-001 für Cholesterin (D), Glukose (E), Phosphor (F) darstellt. Calcium (G), Globin (H), Gesamtprotein (I), ALP (J), ALT (K) und AST (L). Von MSD im Zeitverlauf nach EBT-001 gemessene Zytokine werden für einzelne Tiere für Plasma-IFN-gamma (M), Plasma-IL-7 (N) und Plasma-IL-15 (O) angezeigt. ALP-alkalische Phosphatase, ALT-Alanin-Transaminase, antiretrovirale ART-Therapie, AST-Aspartat-Transaminase, vollständiges CBC-Blutbild, IL-Interleukin, Mo-Monat, MSD-Mesoskalenentdeckung, SEM-Standardfehler des Mittelwerts, SIV-Affenimmundefizienzvirus.

Bei mit EBT-001 behandelten Tieren wurden vor der Infektion, vor EBT-001 oder 3 Monate nach EBT-001 keine nennenswerten Veränderungen der klinischen Chemie oder der hämatologischen Parameter beobachtet (Abb. 5J-L). Die Laboruntersuchung der beiden Tiere in Gruppe 4 (höchste Dosis) am Tag 6 nach der EBT-001-Dosis zeigte jedoch vorübergehende Erhöhungen der Serumkonzentrationen der Leberenzyme alkalische Phosphatase (ALP), Alanintransaminase (ALT) und Aspartataminotransferase ( AST) und im Gesamtserumbilirubin (gemeinsam als Leberfunktionstests bezeichnet) (Abb. S7). Wichtig ist, dass die erhöhten Leberfunktionstests in beiden NHP innerhalb von 1 bis 8 Wochen auf die Ausgangswerte zurückkehrten (Tabelle S10) und bei der mikroskopischen Untersuchung zum geplanten Abschluss der Studie keine Hinweise auf Lebernekrose oder andere Anzeichen einer Leberschädigung beobachtet wurden 6 Monate nach der Dosierung. Die Zytokine Interferon (IFN)-gamma, Interleukin (IL)-7 und IL-15 (Abb. 5M–O) wurden im Plasma von Tieren nach EBT-001 untersucht, um nachteilige Zytokinreaktionen auf AAV9 und Immunreaktionen festzustellen. IFN-gamma war nur bei einem unbehandelten Tier und bei keinem der mit EBT-001 behandelten Tiere erhöht (Abb. 5M). IL-7, wichtig für die Entwicklung von T-Zellen und die Abtötung von HIV, war bei einem Tier aus Gruppe 4 erhöht, und IL-15, das durch natürliche Killerzellen (NK) vermittelte Virusreaktionen aktiviert, nahm bei den behandelten Tieren tendenziell zu (Abb. 5N). -Ö).

Das Potenzial für eine unbeabsichtigte Off-Target-Editierung in den mit EBT-001 behandelten NHPs wurde in Lymphknoten mithilfe einer Gesamtgenomsequenzierungsanalyse (WGS) untersucht, um ein Mittel zur Identifizierung möglicher unbeabsichtigter Editierungsereignisse im gesamten Genom bereitzustellen. WGS wurde an genomischen DNA-Proben aus Lymphknotenbiopsien durchgeführt, die von 2 NHPs, CK49 und CH97, vor der Verabreichung von EBT-001 und von denselben Tieren nach 3 bzw. 6 Monaten Behandlung mit EBT-001 entnommen wurden. WGS wurde mit 2 × 150 bp Paired-End-Sequenzierung und einer durchschnittlichen ~30-fachen Abdeckungstiefe durchgeführt. Um die Sequenzierungslesevorgänge effektiv auszurichten und zu verarbeiten, wurde eine Pipeline in der High-Performance Integrated Virtual Environment (HIVE) entwickelt, einer cloudbasierten Umgebung, die für die Speicherung und Analyse besonders großer Datenmengen wie NGS optimiert ist (9; Ergänzungstext). . Bei der Beurteilung einer unbeabsichtigten Bearbeitung außerhalb des Ziels haben wir uns auf die nominierten Sites mit relativ höherer Homologie zu den Leitsequenzen konzentriert. Die Indelraten wurden für genomische Loci innerhalb von 10 bp der hypothetischen Schnittstellen jedes nominierten Locus berechnet. Als wir die behandelten mit unbehandelten Proben aus Lymphknoten verglichen, identifizierte das erste Screening 5 Stellen mit deutlich unterschiedlicher Anzahl an SNPs (Tabelle 2) mithilfe eines zweiseitigen Chi-Quadrat-Tests mit dem Benjamini-Hochberg-Verfahren zur Kontrolle der Falscherkennungsrate (FDR). ). Wir beobachteten, dass alle diese SNPs an einer von der hypothetischen Schnittstelle entfernten Stelle (7–10 Basen entfernt) auftreten, wobei SNPs sowohl in behandelten als auch in unbehandelten Proben auftraten. Eine weitere Untersuchung dieser Standorte hat gezeigt, dass es keine Belege dafür gibt, diese Veränderungen auf Gen-Editierung zurückzuführen, da die Alignments zu verrauscht sind, lange Abschnitte von Ts um den potenziellen Standort herum vorhanden sind, was zu einer mehrdeutigen Ausrichtung führen kann, oder weil die Abdeckung gering ist (Ergänzungstext). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die relative Änderung der SNP-Häufigkeit zwischen den beiden ausgewählten Tieren an allen fünf Standorten nicht konsistent war. Daher kommen wir zu dem Schluss, dass es keine Belege für Bearbeitungsaktivitäten außerhalb des Ziels gibt. Wir haben diese nominierten Standorte auch auf strukturelle Varianten untersucht und innerhalb von 40-bp-Fenstern rund um die nominierten Schnittstellen keine Lesevorgänge festgestellt, die teilweise Alignments unterstützen. Darüber hinaus untersuchten wir potenzielle AAV-Integrationsereignisse, indem wir nach chimären Lesevorgängen mit teilweiser Ausrichtung suchten. Im Vergleich zu Proben vor der Behandlung ergab die Analyse nur 2 potenzielle Messwerte in CH97 nach der Behandlung und 1 Messwert in CK49 nach der Behandlung. Die beiden Lesevorgänge aus der CH97-Nachbehandlung waren identisch, möglicherweise PCR-Duplikate, und zeigten eine teilweise Ausrichtung auf Chr7:128862755–128862834 mit teilweiser Ausrichtung auf die Cas9-Kodierungsregion (EBT001: 2636–2565). Der erste Messwert in der CK49-Nachbehandlung zeigte auch eine teilweise Ausrichtung auf die Cas9-Kodierungsregion (EBT001: 2944–3037) und eine teilweise Ausrichtung auf Chr12:28738543–28738586 (Abb. S8). Es wurde jedoch festgestellt, dass von diesen drei Lesevorgängen keiner der jeweiligen Lesevorgänge am gepaarten Ende die Ergebnisse der teilweisen Ausrichtung unterstützte. Zusammen mit der äußerst geringen Anzahl unterstützender Messwerte kamen wir zu dem Schluss, dass keiner der drei Split-Read-Sprünge als Beweis für die AAV-Integration in den Lymphknoten nach der EBT-001-Behandlung angesehen werden kann.

Die Behandlung von SIV-infizierten Rhesusaffen mit AAV9 CRISPR-Cas9 und dualen gRNAs, die auf SIV LTR und Gag (EBT-001) abzielen, zeigte eine breite Bioverteilung im Gewebe und Hinweise auf eine Bearbeitung der proviralen SIV-DNA in allen wichtigen Virusreservoirs. EBT-001 wurde in Dosen von 1,4 × 1012 GC/kg, 1,4 × 1013 GC/kg und 1,4 × 1014 GC/kg gut vertragen. Es gab keine klinischen Anzeichen einer Toxizität und keine abnormale grobe Pathologie oder Organhistopathologie, die EBT-001 zugeschrieben werden konnte. Bei einem Tier kam es zu einer infusionsbedingten Reaktion, die vermutlich auf die Anästhesie zurückzuführen war, da die Symptome nach der Verabreichung der Anästhesie und vor der Infusion von EBT-001 begannen, und bei einem anderen Tier entwickelte sich ein Ausschlag an der Infusionsstelle. Bei der höchsten Dosis wurde ein vorübergehender Anstieg der Leberenzyme und des Gesamtserumbilirubins beobachtet. Erhöhte Leberfunktionstests nach der Behandlung mit EBT-001 können auf eine akute Leberentzündung infolge der Behandlung hinweisen. Wichtig ist, dass die erhöhten Leberfunktionswerte in beiden NHP innerhalb von 1–8 Wochen auf die Ausgangswerte zurückgingen. Die vorübergehende Natur der Erhöhungen in Verbindung mit dem Fehlen histopathologischer Anzeichen einer Leberschädigung 6 Monate nach der Behandlung weisen darauf hin, dass die Auswirkungen auf die Leberfunktion reversibel waren.

Eine interessante Beobachtung war das Fehlen eines Gewichtsverlusts bei unserer SIV-infizierten Kohorte, die EBT-001 erhielt, im Gegensatz zu der Beobachtung eines Gewichtsverlusts, der bei NHPs in der ART-only-Gruppe beobachtet wurde. Interessanterweise stellten wir bei unseren NHPs, die die höchste Dosis (1,4 × 1014 GC/kg) EBT-001 erhielten und keine Anzeichen von Gewichtsverlust zeigten, innerhalb von 6 Monaten auch Verbesserungen ihrer absoluten Lymphozytenzahl fest. Obwohl uns keine Daten von unbehandelten Tieren im Alter von 6 Monaten vorliegen, verursachte EBT-001 keinen Anstieg von IFN-gamma. Andere Zytokine, einschließlich IL-10, wurden untersucht, waren jedoch entweder nicht nachweisbar oder es wurden keine Veränderungen festgestellt. Ein Tier in der höchsten Dosisgruppe, BM79, hatte nach 6 Monaten erhöhte IL-7- und IL-15-Werte, aber ohne eine reine SIV-Kontrolle zu diesem Zeitpunkt ist es schwierig abzugrenzen, ob dies eine Reaktion auf AAV oder SIV ist. Darüber hinaus deuten die Daten darauf hin, dass EBT-001 möglicherweise das Immunsystem durch die Wiederherstellung von Lymphozyten, die Entwicklung von T-Zellen und die Erhaltung von NK-Zellen positiv beeinflussen könnte.

Eines der Hauptprobleme beim Einsatz von Gentherapien beim Menschen ist ihr Potenzial, immunologische Reaktionen hervorzurufen, die nachteilige klinische Auswirkungen haben können [14,15,16]. Diese nachteiligen Auswirkungen können auf das Vorhandensein bereits vorhandener Antikörper gegen das AAV-Kapsid, bereits vorhandene Antikörper gegen Cas9 [17], die Bildung von Antikörpern gegen das AAV-Kapsid nach der Vektorbehandlung oder die Bildung von Antikörpern gegen das Transgen oder sein Produkt zurückzuführen sein oder durch weniger spezifische Immunantworten [15]. Die Prävalenz von AAV-Antikörpern ist bei Menschen mit und ohne HIV ähnlich und ähnelt der Prävalenz bei NHPs. AAV9 ist einer der Serotypen mit der geringsten Häufigkeit bereits vorhandener Antikörper in der menschlichen Bevölkerung: ~33,5 % der Menschen haben einen AAV9-nAb-Titer [18, 19]. In unseren Studien wurde 6 Monate nach der Verabreichung von EBT-001 ein Anstieg der neutralisierenden Anti-AAV9-Antikörper in den höchsten Dosierungsgruppen (Gruppe 3, 4) beobachtet. Wir sahen keine Hinweise auf einen Angriff vom Typ ADCC auf normales Gewebe bei Antikörper-tragenden Tieren und die Pathologie war bei allen Tieren ähnlich. Die SIV-DNA-Exzision war immer noch offensichtlich, wie im Blut einzelner Tiere zum frühesten Testzeitpunkt (2 Wochen nach der Verabreichung von EBT-001) und bis zu 6 Monate nach der Verabreichung des Vektors beobachtet wurde. Darüber hinaus waren bei den mit EBT-001 behandelten Tieren weder Monozyten noch IFN-Gamma erhöht, was auf eine entzündliche Reaktion auf EBT-001 oder AAV9 hingewiesen hätte.

EBT-001 verteilte sich gut auf die wichtigsten Organe und Gewebe, die als Virusreservoir von HIV gelten, darunter das Gehirn, ein wichtiges Reservoir für eine HIV-Heilung [20, 21]. Die Expression der EBT-001-DNA wurde dosisabhängig und zeitabhängig nachgewiesen. Insgesamt hatten Tiere, die die 1012-Dosis erhielten, niedrigere log10-Kopien der EBT-001-DNA im Vergleich zu den Tieren, die die 1013- oder 1014-Dosen erhielten, und wiesen zum Zeitpunkt der Autopsie in einigen Geweben, wie Knochenmarkskompartiment, Gehirn und Skelettmuskel, nicht nachweisbare Werte auf und Hoden. Die EBT-001-DNA-Spiegel im Blut nahmen mit der Zeit erwartungsgemäß ab und EBT-001-DNA wurde bei Tieren, die mit der 1013-Dosis behandelt und 3 Monate nach der Infektion obduziert wurden, erst am Ende der Blutung nachgewiesen. Für HIV-Heilungsstudien ist keine anhaltende EBT-001-Expression erforderlich und die im klinischen Umfeld erforderliche AAV-Dosis ist noch nicht bekannt.

Die pharmakologische Geneditierungsaktivität von EBT-001 wurde durch den Nachweis der SIV-DNA-Exzision, der Entfernung dazwischenliegender DNA-Sequenzen zwischen 5'LTR bis Gag und/oder Gag bis 3'LTR, in getesteten Organen und Geweben nach 3 und 6 Monaten nachgewiesen nach Vektorverabreichung. Der 5G-Assay erkennt das Amplikon, das die herausgeschnittene Region zwischen 5'LTR und Gag überbrückt; während der G3-Assay das Amplikon erkennt, das die herausgeschnittene Region zwischen Gag und 3'LTR überbrückt. Bemerkenswert ist, dass bei der Verwendung von gRNAs, die auf LTR und Gag abzielen, drei mögliche Exzisionsprodukte entstehen können. Aufgrund der Homologie zwischen den 5‘- und 3‘-LTRs sind derzeit nur 2 der 3 Exzisionen messbar. Daher unterschätzen wir möglicherweise die Exzision, da wir keine Beweise für die vollständige 5′- bis 3′-LTR-Exzision finden können. Der Erfolg einer der drei möglichen Exzisionen führt jedoch dazu, dass sich das Virus nicht mehr vermehren kann.

Bei jeder Gen-Editing-Plattform stellen mögliche Off-Target-Effekte ein Problem dar, das überwacht werden sollte. Wir haben diese Bedenken in dieser Studie durch bioinformatische Untersuchungen des Rhesusaffen-Genoms gemildert, bei denen keine Genomstellen mit 1, 2 oder 3 Fehlpaarungen zum Leit- und Protospacer-Adjacent-Motiv (PAM) ausgegeben wurden. Für die LTR-Führung wurde eine Stelle identifiziert, die zwei Nichtübereinstimmungen und eine Ausbuchtung aufwies. Es wurden nur wenige Standorte mit 4 oder 5 Unterschieden zwischen den Leitfäden und dem Genom des Rhesusaffen ausgegeben (Tabelle 1). Tests auf mögliche Off-Target-Ereignisse für EBT-101 bei HIV-1-infizierten humanisierten Mäusen ergaben keine nachweisbare Aktivität nach der Behandlung mit den auf HIV abzielenden Leitfäden [6]. Ähnliche Studien wurden durchgeführt, um das SIV-Homolog EBT-001 in einer kleinen Studie einer Einzeldosis-Kohorte von SIV-infiziertem NHP zu testen [4]. Um in dieser Studie mögliche unbeabsichtigte Änderungen festzustellen, suchten die Tests nach Indels und der Möglichkeit größerer Veränderungen, einschließlich Insertionen, Deletionen, Inversionen, Translokationen oder anderen chromosomalen Umlagerungen. Frühere Studien, die die Auswirkungen der CRISPR-Bearbeitung mithilfe einer Reihe verschiedener gRNAs kartierten, fanden überwiegend einzelne Nukleotiddeletionen oder -insertionen, eine geringere Häufigkeit verschiedener kleiner Indels und eine viel geringere Häufigkeit größerer Deletionen und Insertionen [22, 23]. Wenn größere Deletionen auftraten, wurden kleinere Indels häufiger gefunden. Unsere Analyse umfasste daher die Suche sowohl nach Indels als auch nach möglichen größeren Änderungen. Ein deutlicher Vorteil der Kombinationsstudien ist die Möglichkeit, mehrere Pipelines gleichzeitig zu verwenden, um mögliche Bearbeitungen außerhalb des Ziels zu untersuchen und die Daten aus einer Pipeline zu verbessern, um die Genauigkeit der Daten in anderen Pipelines zu verbessern. Wenn beispielsweise strukturelle Veränderungen oder AAV-Insertion an Stellen außerhalb des Ziels festgestellt würden, würden diese hypothetischen Ereignisse durch Beweise aus der Indel-Analyse gestützt, bei denen beobachtet wurde, dass sie an denselben Chromosomenstellen mit einer höheren Anzahl sequenzbestätigter Indels auftreten. Die gleichzeitige Verwendung von Pipelines für Indels, Strukturvariationen und AAV-Insertionen kann daher bei der Untersuchung möglicher niederfrequenter Bearbeitungsstellen hilfreich sein. Hier wurde WGS durchgeführt, ohne unbeabsichtigte Bearbeitungsereignisse zu erkennen und ohne schlüssige Beweise für AAV- oder SaCas9-Insertionen, strukturelle Variationen oder Störungen eines Gens aufgrund der EBT-001-CRISPR-Bearbeitung. Diese NHP-Studien beobachteten die beabsichtigte SIV-Exzisionsaktivität in mehreren untersuchten Geweben, ohne dass eine unbeabsichtigte Bearbeitung erkennbar war.

Diese Studie wurde als präklinische Studie zur Sicherheit und Verträglichkeit von EBT-001 in einem HIV-Großtiermodell konzipiert. Um EBT-101 möglichst genau zu modellieren, wurden die SIV-Führungen nicht auf Schneideffizienz hin optimiert, sondern stattdessen so ausgewählt, dass sie auf die gleichen LTR- und Gag-Bereiche abzielen. Im Gegensatz zu den Leitsequenzen bestehen EBT-001 und EBT-101 aus einem identischen All-in-One-Liefervektor. Die Einschränkungen unserer Studie sind die geringe Anzahl an Tieren pro Gruppe, die begrenzte Zeit der ART vor EBT-001 und das Fehlen einer Unterbrechung der analytischen Behandlung. Die Studie war nicht darauf ausgelegt, die Wirkung auf das intakte Virusreservoir zu testen, da EBT-001 verabreicht wurde, als das Virusreservoir nicht stabil war und noch eine aktive Virusreplikation stattfand. Da die Tiere zusätzlich ART erhielten, haben wir nicht die Fähigkeit von EBT-001 getestet, die Zeit bis zur viralen Erholung zu verlängern oder die virale Reaktivierung nach einer analytischen Behandlungsunterbrechung zu eliminieren. Zusammengenommen unterstützen die Bioverteilungs- und Sicherheitsdaten die weitere Entwicklung der durch AAV9 bereitgestellten CRISPR-Cas9-Dual-gRNA für HIV-Eradikationsheilungsstrategien.

Alle Daten sind im Haupttext oder den ergänzenden Materialien verfügbar. Daten zur Sequenzierung des gesamten Genoms werden bei NCBI SRA unter der Zugangsnummer PRJNA957550 hinterlegt.

Policicchio BB, Pandrea I, Apetrei C. Tiermodelle für die HIV-Heilungsforschung. Frontimmunol. 2016;7:12.

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