Pathologische Analyse und antimikrobielle Empfindlichkeit von Chryseobacterium balustinum RTFCP 298, isoliert aus der erkrankten Regenbogenforelle Oncorhynchus mykiss

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 13268 (2023) Diesen Artikel zitieren

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In dieser Studie wurden sechs Isolate von Chryseobacterium balustinum aus erkrankten Regenbogenforellenjungen charakterisiert. Die Virulenzeigenschaften, die Pathogenität und das antimikrobielle Empfindlichkeitsmuster dieser Isolate wurden untersucht. Das Bakterium zeigte positive Ergebnisse für Katalase, Cytochromoxidase und Aesculinhydrolyse, während negative Ergebnisse für DNase, Gelatinase, Methylrot, Voges-Proskauer-Reaktion, Simoncitrat, Schwefelwasserstoff und Stärkehydrolyse erzielt wurden. Die Analyse des Aminosäurestoffwechsels ergab, dass Arginin, Lysin und Ornithindecarboxylase nicht metabolisiert werden können. Die molekulare Charakterisierung (16S-rRNA) und die phylogenetische Analyse ergaben, dass es sich bei den Testisolaten um C. balustinum handelte, das eng mit dem Stamm WLT (99,85 % Ähnlichkeit) und C. balustinum P-27 (99,77 %) verwandt ist. Der Virulenztest zeigte hämolytische Aktivität und Biofilmbildung durch das Testbakterium. Der Challenge-Test bestätigte eine mäßige Pathogenität bei Regenbogenforellen und bestätigte Kochs Postulate. Zu den klinischen Manifestationen der Infektion gehörten Flossenerosion, Augen- und Körperoberflächenblutung, Exophthalmie und Organverflüssigung. Die minimalen Hemmkonzentrationen verschiedener antimikrobieller Mittel lagen zwischen 1 und > 256 µg mL−1. Die neuartigen synthetischen antimikrobiellen Peptide wiesen MHKs von 8 bis > 256 µg mL−1 auf, was auf eine mögliche Kontrollmethode schließen lässt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass C. balustinum ein opportunistischer Krankheitserreger mit mäßiger Pathogenität bei Regenbogenforellen ist. Weitere Untersuchungen zur Wirt-Pathogen-Beziehung sind erforderlich, um Virulenzeigenschaften und Pathogenität in der Aquakultur zu verstehen.

Die anfängliche Etablierung der Gattung Chryseobacterium umfasste die Neuklassifizierung von sechs Bakterientaxa, die zuvor der Gattung Flavobacterium zugeordnet wurden, nämlich F. balustinum, F. indologenes, F. gleum, F. meningosepticum, F. indoltheticum und F. scophthalmum1. Jüngste Fortschritte in der Molekularbiologie und Biotechnologie haben zu einer verbesserten taxonomischen Klarheit und Identifizierung neuer Chryseobakterienarten beigetragen2. Im Rahmen der taxonomischen Veränderungen innerhalb der Familie Flavobacteriaceae wurden zwei ursprünglich der Gattung Chryseobacterium zugeordnete Arten, nämlich C. meningosepticum und C. miricola, anschließend einer neuen Gattung namens Elizabethkingia3 zugeordnet. Bis 2006 war die Gattung Chryseobacterium auf 10 Arten angewachsen und umfasst derzeit über 60 Arten4. Taxonomisch wird Chryseobacterium in die Gruppen Phylum-Bacteroidota, Klasse-Flavobacteriia, Ordnung-Flavobacteriales, Familie-Weeksellaceae und Gattung-Chryseobacterium eingeteilt.

Chryseobacterium spp. werden mit vielfältigen Infektionen sowohl bei Menschen als auch bei Tieren in Verbindung gebracht. Unter diesen ist C. meningosepticum die am häufigsten an menschlichen Infektionen beteiligte Spezies, die Erkrankungen wie neonatale Meningitis, Lungenentzündung, Bakteriämie, Sepsis und Weichteilinfektionen verursacht und vor allem immungeschwächte Patienten betrifft5,6,7,8. Zu den weiteren Chryseobacterium spp., die aus verschiedenen klinischen und umweltbedingten Quellen isoliert wurden, gehören C. indologenes9 und C. gleum1. Bei Tieren wurden Chryseobakterien im Mitteldarm von Mücken, im Darm von Kakerlaken, im Kot von Tausendfüßlern, im Guano von Pinguinen, in Darmhomogenaten von Süßwasser-Copepoden, in Vogelfedern, in Kuhmilch, in rohem Fleisch und in Hühnern nachgewiesen10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20. Die Gattung Chryseobacterium wurde auch als Krankheitserreger bei verschiedenen Fischarten identifiziert, wobei Chryseobacterium-Arten weltweit als potenziell neu auftretende Krankheitserreger sowohl bei Süßwasser- als auch bei Meeresfischen gelten4,21,22,23,24,25. C. balustinum wurde ursprünglich aus Heilbuttschuppen (Hippoglossus hippoglossus) im Pazifischen Ozean isoliert26. In den letzten Jahren wurden mehrere Chryseobacterium-Arten aus verschiedenen Quellen, einschließlich Knochenfischen, identifiziert und mit bakteriellen Kiemenerkrankungen und systemischer hämorrhagischer Septikämie bei Steinbutt, Scophthalmus maximus L, Kugelfisch, Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) und Atlantischem Lachs (Salmo salar) in Verbindung gebracht ) und goldener Mahseer (Tor putitora)21,22,23,24,27,28,29. Die Inzidenz von Chryseobacterium-Infektionen bei Tieren hat in Südkorea zugenommen, was die Bedeutung einer kontinuierlichen Überwachung und Forschung zu diesem neu auftretenden Krankheitserreger unterstreicht20. Darüber hinaus haben Chryseobacterium-Arten ein erhöhtes Maß an Antibiotikaresistenz gezeigt, einschließlich einer Resistenz gegen Antibiotika der letzten Wahl, was zu Bedenken hinsichtlich ihrer klinischen Auswirkungen und der Möglichkeit einer zoonotischen Übertragung führt30,31.

In dieser Studie wollten wir das Auftreten einer Chryseobacterium-Infektion bei Regenbogenforellen untersuchen, die in Indien in Durchflusskanälen gezüchtet werden. Durch den Einsatz einer Kombination aus biochemischen und molekularen Testtechniken konnten wir das Bakterium erfolgreich identifizieren. Um die Pathogenität zu beurteilen, führten wir Virulenztests und einen Challenge-Assay durch. Darüber hinaus haben unsere Forschungen eine besondere Strategie zur Kontrolle des Wachstums von Chryseobacterium in vitro aufgedeckt, indem wir dessen minimale Hemmkonzentration gegen neuartige synthetische antimikrobielle Peptide und andere Antibiotika bestimmen.

Die durchgeführten Versuchsprotokolle und die Verwendung von Regenbogenforellen in der Studie wurden vom Institute Animal Care and Use Committee (IACUC) des ICAR-Direktorats für Kaltwasserfischereiforschung, Bhimtal, Indien, genehmigt (Aktenzeichen: ICAR-DCFR/IACUC/12/06). /2020/07-B) und entsprachen dem Institutional Biosafety Committee (IBSC), dem Department of Biotechnology (DBT) und dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie der indischen Regierung gemäß den Regeln für „Herstellung, Verwendung/Import/Export und Lagerung“. of Hazardous Microorganisms/ Genetically Engineered Organisms or Cells, 1989 (Rules 1989) of Environment (Protection) Act 1986.“ Die Studie wurde gemäß den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Darüber hinaus haben wir auch bestätigt, dass die in der Studie präsentierten Methoden und Ergebnisse den ARRIVE-Richtlinien und -Vorschriften entsprechen32.

Zwanzig (n = 20) sterbende junge Regenbogenforellen (mittlere Länge 16,5 ± 0,125 cm; mittleres Gewicht 34,5 ± 0,512 g) wurden von drei Regenbogenforellenfarmen in der indischen Himalaya-Region gewonnen. Sechs erkrankte Regenbogenforellen wurden aus Zuchtbetrieb 1 beprobt, während aus Zuchtbetrieb 2 und Zuchtbetrieb 3 jeweils sieben erkrankte Individuen stammten. Zu Diagnose- und Forschungszwecken wurde eine repräsentative Fischprobe der betroffenen Population in jedem Betrieb entnommen. Das Auftreten von Krankheiten wurde nicht im gesamten Betrieb beobachtet. Stattdessen beschränkten sich die Infektionen auf nur zwei bis drei Laufbahnen innerhalb jedes Betriebes. Die gesammelten erkrankten Regenbogenforellen zeigten pathologische Erscheinungen, darunter Blutungen auf der Rückenoberfläche des Körpers, schwarze Pigmentierung, Flossenfäule und tiefe Läsionen in den Schwanzstielregionen. Um potenzielle parasitäre oder virale Infektionen zu identifizieren, wurde eine Untergruppe von 10 sterbenden Regenbogenforellenexemplaren sorgfältig für die Verarbeitung und Untersuchung ausgewählt, darunter 3 Exemplare von Farm 1, 3 von Farm 2 und 4 von Farm 3. Um dies zu erreichen, Kiemenkürbis und Körperoberflächenabschabungen der Regenbogenforelle wurden auf vorgereinigten Objektträgern gesammelt und einer mikroskopischen Analyse unterzogen, um etwaige parasitäre Infektionen zu identifizieren. Darüber hinaus wurden degenerierte PCR-Primer, die auf die DNA-Polymerasen von aquatischen Herpesviren, Pockenviren, Iridoviren und Adenoviren in Leber und Niere abzielen, zum Screening nach viralen Signaturen eingesetzt33,34.

Von allen drei Regenbogenforellenfarmen wurden Wasserproben zur Beurteilung wichtiger Wasserqualitätsparameter entnommen, darunter Wassertemperatur, gelöster Sauerstoff, pH-Wert, insgesamt gelöste Feststoffe und gesamter Ammoniakstickstoff. Die Messungen wurden mit einer digitalen Sonde (HANNA HI 9829, HI Media TDS/TEMP-3) und einem handelsüblichen Wasserqualitätsparameter-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (HIMEDIA WT028, WT042A) durchgeführt.

Die restlichen 10 Lebendproben wurden für die bakteriologische Untersuchung aufbereitet. Abstrichproben wurden aus den kaudalen Stielregionen der infizierten Forellenproben entnommen. Zur Entnahme der Gewebeproben (Leber und Niere) wurden die Jungforellen mit 150 mg L−1 Ethyl-3-aminobenzoatmethansulfonat (MS 222) eingeschläfert, um sie an einen humanen Endpunkt zu bringen35,36. Anschließend wurden die Proben mit 70 %igem Ethanol desinfiziert, bevor Gewebeproben zur Isolierung pathogener Bakterien als ätiologische Erreger für die in der Studie erfassten pathologischen Zustände und Infektionen entnommen wurden. Die Gewebe- und Abstrichproben wurden aseptisch auf verschiedenen Medien verarbeitet; Shieh-Agar (ergänzt mit 0,5 µg mL-1 Tobramycin; pH 7,2) und Hsu-Shotts-Agar (ergänzt mit 4,0 µg mL-1 Neomycinsulfat; pH 7,2). Die Platten wurden eine Woche lang bei 15 °C und 24–48 Stunden lang bei 25 °C inkubiert. Die bei 25 °C inkubierten Platten zeigten das Wachstum von gelben, schleimigen, pigmentierten Kolonien, wohingegen die bei 15 °C inkubierten Platten keine Entwicklung von gelben, schleimigen, pigmentierten Kolonien zeigten. Die gelblichen und schleimdominanten Kolonien (n = 6) wurden zufällig ausgewählt und auf den 30 % KOH-Test untersucht. Die Isolate wurden weiter auf Tryptic Soya-Agar (TSA) bei 25 °C für 24–48 Stunden subkultiviert und zur Langzeitlagerung in 20 % Glycerin bei –20 °C konserviert.

Die biochemische Identifizierung der Isolate erfolgte gemäß den zuvor veröffentlichten Standardmethoden37,38,39. Gemäß dem Protokoll des Herstellers wurde die Gramme-Reaktion von Bakterienisolaten mit einem Gram-Färbekit (HI MEDIA K001-1KT) bestimmt. Die Isolate wurden auf die grundlegenden biochemischen Reaktionen wie Cytochromoxidase, Katalase, Simoncitrat, Methylrot (MR), Voges-Proskauer-Reaktion (VP), Schwefelwasserstoff, Stärke- und Aesculinhydrolyse, DNase und Gelatinase, Urease, Nitrat, getestet. Indol, Tyrosin, Arginindihydrolase, Lysin-Decarboxylase und Ornithin-Decarboxylase. Sie wurden auch auf die Säureproduktion aus Zucker getestet; Mannitol, Raffinose, Mannose, Saccharosexylose, Salicin, Trehalose, Inositol, Glucose, Arabinose und Lactose für die biochemische Analyse. Kurz gesagt, ein Stück steriles Filterpapier, das mit frisch zubereitetem Oxidase-Reagenz imprägniert war, wurde in eine Petrischale gelegt. Mit Hilfe eines sterilen Platinschleifen-Cytochromoxidase-Tests wurde ein Streifen der Testbakterienkultur über das Filterpapier gestrichen. Für den Katalase-Test wurde die Kolonie des Testbakteriums auf einen sauberen Glasobjektträger ausgestrichen. Anschließend wurde ein Tropfen 30 %iges H2O2 auf den Abstrich gegeben. Die Fähigkeit der Testbakterien, Citrat als einzige Kohlenstoffquelle zu nutzen, wurde getestet, indem die Kultur 24–48 Stunden lang bei 28 °C auf Simmons-Citrat-Schrägagar gezüchtet wurde. Für den MR-Test wurden der 48–72 Stunden lang in MR-VP-Brühe gewachsenen Kultur einige Tropfen Methylrot-Reagenz zugesetzt. Im Fall des VP-Tests wurden VP-Reagenzien (Lösung A – 0,6 ml und Lösung B – 0,2 ml) zu der 48–72 Stunden lang gewachsenen Bakterienkultur in der MR-VP-Brühe hinzugefügt. Eine Öse der Bakterienkultur wurde aseptisch in die Tryptic-Soja-Brühe überführt und 24–48 Stunden lang bei 28 °C inkubiert. Sobald das Bakterienwachstum in der Brühe beobachtet wurde, wurde der Brühe, die mit der Bakterienkultur im Schwefelwasserstofftest gezüchtet wurde, Eisensulfatlösung als Schwefelwasserstoffindikator zugesetzt. Der Stärkehydrolysetest wurde durch punktuelle Inokulation einer jungen Testbakterienkultur auf eine Stärkeagarplatte durchgeführt. Nach 18–24 Stunden Inkubation bei 28 °C wurden die Platten mit Lugols Jodlösung geflutet. Beim Aesculin-Test wurden Bakterienzellen in Aesculin-Bouillon inokuliert und 24–48 Stunden bei 28 °C inkubiert. Eine Bakterienkulturschleife wurde als einzelne Linie auf DNase-Agarplatten ausgestrichen. Die Platten wurden 2–4 Tage bei 28 °C inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Platten mit 1 % HCl geflutet. Für den Gelatinase-Test wurde die Gelatineplatte punktuell mit Bakterienkultur beimpft und 24–48 Stunden bei 28 °C inkubiert. Für den Ureasetest ließ man die Testbakterien 6–24 Stunden lang auf Harnstoff-Schrägagar bei 28 °C wachsen und beobachtete sie 6 Tage lang. Der Nitrattest wurde durch Stich- oder Streifenimpfung der Testkultur auf Nitrat-Agarröhrchen und anschließende Inkubation der Röhrchen bei 28 °C für 24–48 Stunden durchgeführt. Dann wurde Nitratlösung in das Röhrchen gegeben. Der Indoltest wurde durchgeführt, indem schweres Inokulum der Testkultur in Röhrchen in Tryptonbrühe gegeben wurde. Die Röhrchen wurden für einen Zeitraum von 48 Stunden bei 28 °C inkubiert. Dann wurden 6–7 Tropfen Kovacs-Reagenz in die Röhrchen gegeben. Beim Tyrosintest wurde eine Testkultur mit einer Öse in Tyrosinbrühe geimpft und die Kultur 24–48 Stunden lang bei 28 °C inkubiert. Nach Beobachtung des Bakterienwachstums wurde ein Durham-Röhrchen in die Tyrosinbrühe eingeführt und weitere 24–48 Stunden bei 28 °C inkubiert. Die Fähigkeit der Testbakterienkultur, Arginin-Dihydrolase, Lysin-Decarboxylase und Ornithin-Decarboxylase zu produzieren, wurde durch Beimpfen der Testkultur in das Medium, das diese 3 Aminosäuren enthielt, in separaten Röhrchen getestet. Die Röhrchen wurden mit sterilem flüssigem Paraffin überschichtet und bei 28 °C inkubiert. Für jeden Test wurden auch Kontrollröhrchen mit dem Basismedium inkubiert. Die Röhrchen wurden eine Woche lang beobachtet. Die Fähigkeit der Bakterien, aus Zucker Säure zu produzieren; Mannitol, Raffinose, Mannose, Saccharosexylose, Salicin, Trehalose, Inositol, Glucose, Arabinose und Lactose wurden getestet, indem das Basismedium mit einzelnen Zuckern in separaten Röhrchen ergänzt wurde. Anschließend wurden die Röhrchen mit Bakterienkultur beimpft und bei 28 °C inkubiert.

Mit dem Promega DNA Isolation Kit wurden die auf der Agarplatte gewachsenen Kolonien verarbeitet, um die DNA zu isolieren und das 16S-rRNA-Gen mittels PCR zu analysieren. Für die PCR-Amplifikation wurden die Universalprimer UFF2 (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′) und URF2 (5′-ACG GGC GGT GTG TTC-3′) verwendet, die auf das 16S-rRNA-Gen abzielten. Bei der PCR-Reaktion wurde die Amplifikation von Amplifikaten mit einer Größe von 1400 Basenpaaren erreicht. Das PCR-Produkt wurde zur Nukleotidsequenzierung nach der Sanger-Sequenzierungsmethode mit Hilfe eines ABI Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1 und ABI 3730 XL (Applied Biosystems) geschickt. Die partiellen Vorwärts- und Rückwärtssequenzen des 16S-rRNA-Gens wurden zusammengestellt (CLC Genomics Workbench-Software, Version 11.0.1) und die Ähnlichkeitssuche wurde mit den anderen Chryseobacterium spp. unter Verwendung von BLASTn (NCBI, Bethesda, MD, USA) durchgeführt. Die 16S-rRNA-Gene aller Isolate (n = 6) waren zu 100 % identisch. Das Testisolat wurde als Laborstamm Nr. RTFCP 298 bezeichnet und dem NCBI als C. balustinum, RTFCP 298 (OP 604186) als Vertreter vorgelegt. Die eng verwandten Sequenzen von C. balustinum RTFCP 298 und anderen Arten der Gattung wurden zusammen mit Typstämmen und einigen indischen Isolaten vom NCBI abgerufen. Die mehrfachen Ausrichtungen wurden von CLUSTAL W40 durchgeführt.

Die ausgerichteten Sequenzen wurden verwendet, um die Evolutionsgeschichte gemäß dem Neighbour-Joining-Algorithmus41 durch Molecular Evolutionary Genetic Analysis (MEGA X)42 abzuleiten. Die Maximum-Likelihood-Methode und das Kimura-2-Parameter-Modell wurden verwendet, um die Evolutionsgeschichte abzuleiten, und der Baum mit der höchsten logarithmischen Wahrscheinlichkeit (− 6459,57) wird zusammen mit dem Prozentsatz der zugehörigen, gruppierten Taxa dargestellt. Um den Ausgangsbaum für die heuristische Suche zu erhalten, wurde die Neighbour-Joining-Methode auf eine paarweise Distanzmatrix angewendet, die mithilfe des Maximum Composite Likelihood (MCL)-Ansatzes geschätzt wurde. Der Baum wurde maßstabsgetreu gezeichnet, wobei die Astlängen in Ersetzungen pro Standort gemessen wurden. Die Analyse umfasste 22 Nukleotidsequenzen, einschließlich der 1., 2., 3. und nicht-kodierenden Stellen, mit insgesamt 1548 Positionen im endgültigen Datensatz. Der Acinetobacter calcoaceticus-Stamm NCCB 22016 (NR042387) wurde als Fremdgruppe in die phylogenetische Analyse einbezogen.

Zur phänotypischen Bestimmung der In-vitro-Virulenzeigenschaften von C. balustinum RTFCP 298 wurden ein Biofilm-Assay43 und hämolytische Aktivitäten durchgeführt.

In Polystyrol-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden wurden 30 µL von 108 KBE mL-1 C. balustinum RTFCP 298 mit 200 µL verschiedener Wachstumsmedien (HSU-SHOT, Cytophaga und SHIEH) mit Glucose und ohne Glucose (0,45 %) ausgesät. und 24–48 Stunden bei 25 °C inkubiert. Die Planktonzellen wurden durch zweimaliges Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,4 entfernt. Die Färbung erfolgte durch Zugabe von 150 µL 0,1 % Kristallviolett und einer Inkubationszeit von 1 Stunde bei 25 °C, gefolgt von Waschen mit PBS (pH 7,4). Schließlich wurde der durch anhaftende Bakterien erworbene Fleck durch Zugabe von 200 µL 95 %igem Ethanol aufgelöst und 1 Stunde lang bei 4 °C gehalten. Die Biofilmbildung wurde durch Messung der optischen Dichte bei 590 nm quantifiziert.

Der hämolytische Test wurde in einer Polystyrol-Mikrotiterplatte mit U-förmigem Boden und 96 Vertiefungen unter Verwendung von defibriniertem Schafsblut durchgeführt44. Das aseptisch gesammelte frische defibrinierte Schafsblut wurde dreimal mit PBS gewaschen, 10 Minuten lang bei 1000 × g zentrifugiert und bei 10 % (v/v) in PBS, enthaltend 10 mM Dithiothreitol (DTT), resuspendiert. Die Schaferythrozyten wurden mit der frisch gezüchteten Reinkultur von C. balustinum RTFCP 298 in absteigender Konzentrationsreihenfolge inkubiert; 1,5 × 108, 1,5 × 106, 1,5 × 104 und 1,5 × 102 KBE ml−1 bei 25 °C für 1 Stunde. Als Negativ- bzw. Positivkontrolle wurden PBS (100 μL) und 0,2 % Triton X-100 (100 μL) verwendet. Nach der Inkubation der Platte folgte eine 10-minütige Zentrifugation bei 1000 × g und die Übertragung des Überstands auf eine Polystyrol-Mikrotiterplatte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen. Die Absorption der Platte wurde bei 540 nm gemessen, um die Lyse des Erythrozyten abzuschätzen.

Der Prozentsatz der Hämolyse wurde wie folgt berechnet:

Hämolyse (%) = 100 × [(ASample − APBS)/(ATriton X−100 − APBS)], wobei 0,2 % Triton X-100 und PBS Positivkontrolle bzw. Negativkontrolle sind.

Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durch die Brühenverdünnungsmethode gemessen45. Das Muller-Hinton-Bouillonmedium (50 µL), das abnehmende Konzentrationen (256–0,125 µg mL−1) an Antibiotika enthält (n = 5); Erythromycin, Florfenicol, Neomycin, Ampicillin und Oxytetracyclin sowie 15 AMPs wurden mit 105 KBE ml C. balustinum RTFCP 298 in 96-Well-Mikrotiterplatten beimpft, wobei jede Platte eine Positivkontrolle (nur Bakterienzellen) und eine Negativkontrolle enthielt ( Brühe ohne Bakterien). Die MHK-Werte wurden nach 18–20 Stunden Inkubation bei 25 °C anhand der niedrigsten Konzentration an Antibiotika und AMP bestimmt, bei der kein sichtbares Wachstum auftrat. Die 10 μl frisch zubereitetes Resazurin (0,015 %), verdünnt in PBS, wurden in alle Vertiefungen der MIC-Platte gegeben und 2 Stunden lang bei 25 °C inkubiert. Die Farbe des gesamten Brunnens wurde aufgezeichnet. Eine blaue Farbe in der Vertiefung wurde als kein Wachstum interpretiert, wohingegen die Entwicklung einer rosa Farbe als Wachstum des Testbakteriums gewertet wurde. Die MHK wurde als die niedrigste Antibiotika-/Peptidkonzentration definiert, die einen Farbumschlag von Blau nach Rosa verhindert.

Um die Pathogenität von C. balustinum RTFCP 298 zu beurteilen, führten wir eine experimentelle Infektion bei Regenbogenforellenfischen mit einem Durchschnittsgewicht von 25,0 ± 0,028 g und einer Länge von 12,5 ± 0,50 cm durch. Die gesunden Jungfische wurden für den Challenge-Test auf der staatlichen Regenbogenforellenfarm in Bairangna im Bezirk Chamoli, Uttarakhand, gesammelt. Vor der experimentellen Infektion in einem Durchflusssystem wurden die Testfische (n = 30) 15 Tage lang in FRP-Tanks mit einem Fassungsvermögen von jeweils 500 l an die feuchten Laborbedingungen gewöhnt. Kiemen-, Leber- und Nieren- sowie Abstrichproben Die von zufällig ausgewählten Regenbogenforellenfischen (n = 6) gesammelten Proben wurden auf SHIEH- und Hsu-Shotts-Agarmedien verarbeitet, wie zuvor für das Screening von C. balustinum vor Beginn der experimentellen Infektion beschrieben. Die frische Kultur der Testbakterien wurde 24 Stunden lang bei 25 °C in SHIEH-Brühe inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert und zweimal mit steriler 0,85 % PBS gewaschen. Für die experimentelle Infektion behielten wir eine konstante Zelldichte von 3,0 × 106, 3,0 × 107 und 3,0 × 108 KBE ml−1 bei (DEN-1 McFarland-Densitometer, Grant-bio, England). Um Kochs Hypothesen zu testen, wurden 100 µL von 3,0 × 106, 107 und 108 KBE C. balustinum RTFCP 298 gesunden Regenbogenforellenjunglingen intraperitoneal in dreifacher Behandlungsgruppe verabreicht und auf Krankheitsprogression, abnormales Verhalten, Fütterung und Mortalität überwacht. Der Kontrollgruppe wurden 100 µL 0,85 % phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) injiziert. Die Wassertemperaturen der Versuchstanks wurden auf 18 °C gehalten. Nach der Post-Challenge-Phase wurden die zufällig aus jeder Versuchsgruppe ausgewählten infizierten Jungtiere (n = 6) erneut aseptisch auf SHIEH-Agarmedium, ergänzt mit 0,5 g mL-1 Tobramycin, Hsu-Shotts-Agar, ergänzt mit 4,0 µg mL-1 Neomycin, verarbeitet Sulfat und TSA, wie zuvor beschrieben. Dies geschah, um das Vorhandensein von C. balustinum in den Organen der betroffenen Regenbogenforelle erneut zu isolieren und zu bestätigen. Der experimentelle Versuch wurde 90 Tage lang durchgeführt.

Die Kiemen-, Leber-, Nieren-, Augen-, Milz-, Darm- und Muskelgewebe der experimentell infizierten Regenbogenforellen wurden getrennt gesammelt und mit Davidsons Fixiermittel für 12–16 Stunden fixiert46,47. Die fixierten Gewebeproben wurden nach und nach dehydriert und Blöcke wurden in einem eingebetteten O-Ring (HI Media, Indien) hergestellt. Kurz gesagt, die Gewebeproben wurden in aufsteigendem Ethylalkohol (50–100 %) dehydriert und dann zweimal in dem Klärmittel Xylol eingeweicht, um das Dehydratisierungsmittel vollständig zu entfernen. Die Gewebe wurden 4–6 Stunden lang bei 60–61 °C in geschmolzenes Paraffinwachs eingebettet, gefolgt von der Vorbereitung der Blöcke durch Einbetten eines „O“-Rings. Es wurden dünne Schnitte (4,0 µm) geschnitten (Micron HM 325, Thermo Scientific, USA) und mit Eialbumin und Glycerin im Verhältnis 1:1 auf die doppelt mattierten Glasobjektträger geklebt. Nach einstündigem Backen der Objektträger bei 37 °C wurden die Gewebeschnitte mit 2 % H & E-Färbung48 angefärbt und unter dem Mikroskop (Leica DM 3000) weiter auf histopathologische Veränderungen untersucht.

Daten zur Biofilmbildung wurden als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt (Prism Version 5.01 GraphPad-Software). Die signifikanten Unterschiede (p < 0,01) in der Biofilmbildung durch C. balustinum RTFCPB 279 in verschiedenen glukosereichen und glukoselimitierenden Medien wurden durch eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) bewertet. Um die signifikante Variation (p < 0,01) der hämolytischen Aktivität zwischen der RTFCPB 279-Konzentration von C. balustinum bei 108 und 106 KBE ml−1 zu untersuchen, wurde der gepaarte „t“-Test durchgeführt. Für die statistische Analyse in der vorliegenden Studie wurde die SPSS-Softwareversion 19.0 (SPSS Inc, Chicago IL) verwendet.

Während der Entnahme von Proben erkrankter Regenbogenforellen waren die Durchschnittswerte der Wasserqualitätsparameter in den Forellenfarmen wie folgt: Wassertemperatur 18,5 °C, Konzentration des gelösten Sauerstoffs 8,5 mg L−1, pH-Wert 7,5, insgesamt gelöste Feststoffe 45 mg L−1 und ein Gesamtammoniakstickstoffgehalt (TAN) von 0,01 mg L−1, was darauf hinweist, dass die Parameter im optimalen Bereich lagen.

Die in der Studie erfassten klinischen Symptome waren schwarze Pigmentierung, Blutungen in der Körperrückenoberfläche, Flossenfäule und tiefe Läsionen in den Schwanzstielregionen. Die mikroskopische Untersuchung von Proben, die aus erkrankten Regenbogenforellen hergestellt wurden, ergab keine parasitären Infektionen. Der PCR-basierte Nachweis auf aquatische Herpesviren, Pockenviren, Iridoviren und Adenoviren mittels degenerierter Primer verlief negativ. Die kreisförmigen gelben Kolonien (n = 6) erschienen auf HSU-SHOT-Agarmedium nach 24–48 Stunden Inkubation bei 25 °C. Beim Pigmentierungstest (30 % KOH-Reaktion) wurde das Vorhandensein des Wirkstoffs Flexirubin in allen 6 Isolaten nachgewiesen, indem gelbe, schleimige Bakterienkolonien eine ziegelrote Farbe annahmen.

Die Isolate waren positiv im Gram-Reaktions-, Katalase- und Cytochromoxidase-Test. Die anderen grundlegenden biochemischen Reaktionen zeigten, dass die Isolate negativ auf DNase, Gelatinase, Methylrot, VP-Reaktion, Simon-Citrat und Stärkehydrolyse waren. Sie stellten Säure aus Mannitol, Raffinose, Mannose, Saccharose und Xylose her. Die Einzelheiten der biochemischen Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die molekulare Charakterisierung (16S-rRNA-Gen) und die phylogenetische Analyse der Sequenzen von C. balustinum, RTFCP 298, hatten eine maximale Ähnlichkeit von 99,85 % mit dem C. balustinum-Stamm WLT (MN317337), gefolgt von 99,77 % mit C. balustinum P-27 (KF318411). ), 99,33 % mit C. balustinum (NR 042925) und 99,15 % mit C. balustinum NBRC 15053 (NR 113721). Die C. balustinum-Stämme RTFCP 301, 302, 303 und 304 zeigten 100 % Sequenzähnlichkeit mit C. balustinum RTFCP 298, was auf eine enge genetische Verwandtschaft zwischen diesen Isolaten schließen lässt. Diese Stämme wurden zusammen mit C. balustinum RTFCP 298 aus den erkrankten Regenbogenforellenproben gewonnen, wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben. Der phylogenetische Baum umfasste die Analyse von 24 Nukleotidsequenzen und stellte in der Studie auch die Identifizierung des vorliegenden Stamms RTFCP 298 als C. balustinum sicher (Abb. 1).

Die phylogenetische Analyse wurde unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Methode mit dem Kimura-2-Parameter-Modell durchgeführt, wobei 500 Bootstrap-Replikationen verwendet wurden, die die 1., 2., 3. und nicht-kodierende Sites umfassten. Der resultierende Baum mit der höchsten Log-Wahrscheinlichkeit (− 6449,11) wird dargestellt und gibt den Prozentsatz der Bäume an, bei denen zugehörige Taxa entlang der Zweige gruppiert waren. Erste Bäume für die heuristische Suche wurden durch Anwendung der Neighbour-Joining-Methode auf eine paarweise Distanzmatrix generiert, die mithilfe des Maximum Composite Likelihood (MCL)-Ansatzes geschätzt wurde. Der Baum ist skaliert, wobei die Zweiglängen in Substitutionen pro Standort gemessen werden. Diese Analyse umfasste 24 Nukleotidsequenzen und der endgültige Datensatz bestand aus 1541 Positionen. Alle Evolutionsanalysen wurden mit MEGA X durchgeführt.

MHKs wurden gegen 5 verschiedene Antibiotika und 15 synthetische neuartige antimikrobielle Peptide bestimmt. Alle getesteten antimikrobiellen Mittel zeigten ein unterschiedliches Muster der antimikrobiellen Aktivität gegen C. balustinum RTFCP 298, wobei die MHK-Werte zwischen 1 und > 256 Μg mL−1 gegen Antibiotika variierten; Oxytetracyclin, Erythromycin, Florfenicol, Neomycin und Ampicillin (Tabelle 2). Ebenso variierten die MHKs synthetischer antimikrobieller Peptide von 8 bis > 256 Μg mL−1 (Tabelle 3).

Der Biofilmbildungstest ergab, dass C. balustinum RTFCP 298 in Gegenwart von Glucose im Vergleich zur glukoselimitierenden und mittleren Kontrolle innerhalb des Mediums über den Versuchszeitraum (24–48 Stunden) einen signifikanten Biofilm (p < 0,01) bildete. Im Vergleich zwischen glukosereichen Medien; HSB, CB und SHIEH, die Biofilmbildung war in glukosereichem SHIEH-Medium nach 24 und 48 Stunden signifikant (p < 0,01) (Abb. 2A-B).

(A–B) Biofilmbildung durch C. balustinum RTFCP 298 in glukosereichem und glukoselimitierendem Medium bei (A) 24 h und (B) 48 h; HSB: HSU-Shot-Brühe, SHIEH: Shieh-Brühe und CB: Cytophaga-Brühe. Signifikante Unterschiede in der Biofilmbildung wurden zwischen glukosereichen und glukoselimitierenden Bedingungen mit dem Medium aufgezeichnet (p < 0,01). Die Biofilmbildung war im glukosereichen SHIEH-Medium nach 24 und 48 Stunden ebenfalls signifikant (p < 0,01) im Vergleich zu anderen glukosereichen Medien.

C. balustinum RTFCP 298 zeigte hämolytische Aktivität auf Schaferythrozyten. Bei 1 × 108 KBE ml–1 der Testkultur wurde eine 100 %ige Hämolyse beobachtet, während bei einer zweifachen Reihenverdünnung (108 KBE ml–1) die hämolytische Aktivität 16,6 % betrug, was die Virulenzcharakteristik von C. balustinum bestätigt RTFCP 298 in vitro. Weitere Verdünnungen in der Konzentration von C. balustinum RTFCP 298 ergaben keine hämolytische Aktivität (Abb. 3).

Phänotypische Expression der hämolytischen Aktivität von C. balustinum RTFCP 298. Hämolyse (%) berechnet gegen +ve-Kontrolle Triton X-100 (0,2 %) und Neat 108 CFU mL−1.

C. balustinum erwies sich bei der experimentellen Infektion als mäßig pathogen für Regenbogenforellenjunglinge, was Kochs Postulat bestätigte. Die Zeit nach der Belastung verlief mit der Entwicklung anfänglicher pathologischer Zustände und Krankheitssymptome wie Blutungen in den Augen, schwarzer Pigmentierung, roten Flecken und Lethargie am zweiten Tag in allen Versuchsgruppen. Während der gesamten Versuchsdauer (90 Tage) wurde die Entwicklung von Hautausschlägen und Hauterosion an der Basis der Brustflossen sowie eine deutliche Verringerung der Futteraufnahmekapazität bei den belasteten Fischen beobachtet. Blutungen in den Augen experimentell infizierter Fische führten allmählich auch zu einseitigen und beidseitigen Exophthalmiezuständen. Die Autopsie verstorbener oder kürzlich verstorbener Versuchsfische ergab eine Verflüssigung der inneren Organe, Blutungen in der Leber und eine abnormale Gallenblase (Abb. 4).

Grobe klinische und pathologische Anzeichen bei Regenbogenforellen, O. mykiss, experimentell herausgefordert mit C. balustinum. (a) Hautnekrose oder diffuse seitliche Schuppentasche. (b) Subperitoneale Region – Splenomegalie und diffuse Petechien. (c) Augenblutung in der Vorderkammer. (d) Exophthalmie, Blutungen im Auge und dorsale Verfärbungen sind im Schädelbereich sichtbar. (e) Augenblutung in der Vorderkammer, (f) Blutung und Verflüssigung im inneren Organ und (g) Aszitesausfluss aus dem Anus.

Erste Mortalitätsepisoden von 12 % bzw. 15 % wurden in der Fischgruppe verzeichnet, die mit 3,0 × 107 bzw. 3,0 × 108 KBE ml C. balustinum RTFCP 298 provoziert wurde, jeweils nach dem 4. Tag der experimentellen Infektion. Die Versuchsgruppe, die mit 3 × 106 KBE ml-1 des Testbakteriums in Kontakt gebracht wurde, verursachte keine Mortalität, zeigte jedoch die Entwicklung einiger Anzeichen einer Krankheitsprogression. Am 15. Tag der Zeit nach der Exposition wurde eine Sterblichkeit von 4 % in der Fischgruppe verzeichnet, die mit 3 × 106 KBE ml–1 C. balustinum RTFCP 298 infiziert war. Der LD50-Wert von C. balustinum RTFCP 298 wurde bei 108 KBE ml aufgezeichnet −1, was zu einer Sterblichkeit der Testfische von 50 % am 29. Tag führte. Die Fische in der Kontrollgruppe des Experiments zeigten keine Anzeichen eines Fortschreitens der Krankheit und bei den Fischen dieser Gruppe wurde keine Mortalität beobachtet. C. balustinum RTFCP 298 wurde aus der infizierten Regenbogenforelle auf SHIEH-Agarmedium, ergänzt mit 0,5 g mL-1 Tobramycin, und Hsu-Shotts-Medium, ergänzt mit 4,0 g mL-1 Neomycinsulfat, erneut isoliert und die phänotypische und partielle 16S-rRNA-Genhomologie bestätigt die Charakterisierung. In der Studie wurden auch einige Isolate der Aeromonas-Gruppe auf der TSA-Platte identifiziert.

Zu den histopathologischen Veränderungen im Kiemengewebe gehörten die Verschmelzung der primären und sekundären Kiemenlamellen, Hypertrophie, Hyperplasie, Vakuolisierung, Epitheliallifting, Teleangiektasie in den Sekundärlamellen, Blutstau und Gefäßerweiterung. In der Leber zeigte sich eine Vakuolisierung, eine Vergrößerung des Sinusraums, des Hepatozytenkerns und der Blutsinusoide, während in der Niere Blutungen und eine Erweiterung des Bowman-Raums beobachtet wurden. Die Milz zeigte eine Ansammlung von Hämosiderin sowie weißer und roter Pulpa. Das Auge hatte einen vergrößerten Raum zwischen pigmentiertem Epithel und Photorezeptorschicht und eine Zapfen-Stäbchen-Dystrophie. Im Darm wurden Nekrose, Störung des Bürstensaums und Degeneration der Lamina propria beobachtet, wohingegen im Muskel Nekrose und Myozytenverluste auftraten (Abb. 5).

Mikrophotographie histologischer Schnitte (4 μm) von Regenbogenforellen, die mit C. balustinum RTFCP 298 infiziert wurden. (A) Auge: Vergrößerung des Raums (IS) zwischen pigmentiertem Epithel und Photorezeptorschicht und Zapfen-Stäbchen-Dystrophie (CRD); (B) Kieme: Epitheliale Anhebung (EL), Teleangiektasie (T), Blutstauung (BC), Hyperplasie (HP) und Vasodilatation (V); (C) Darm: Nekrose (N), Störung des Bürstensaums (DB), Degeneration der Lamina propria (DLP); (D) Niere: Blutung (H), Erweiterung des Bowman-Raums (DB); (E) Leber: Vakuolisierung (V), Vergrößerung des Sinusraums (IS), Hepatozyten (HE), Hepatozytenkern (HN), Blutsinusoide (BS); (F) Muskel: Nekrose (N), Myozytenverluste (ML), (G) Milz: Ansammlung von Hämosiderin (AH), weiße Pulpa (WP), rote Pulpa (RP).

In der vorliegenden Studie wurden C. balustinum RTFCP 298-Isolate aus der natürlichen Infektion von Regenbogenforellen in den indischen Himalaya-Regionen (IHR) gewonnen und charakterisiert. Die Krankheitssymptome ähnelten den Fällen einer Infektion mit Flavobacterium spp. in Fisch49. Seit der ersten Isolierung von Heilbutt wurde es als pathogenes Bakterium und nicht als lebensmittelverderbendes Bakterium erkannt, da es aus der Flosse isoliert wurde4,26,50.

C. balustinum RTFCP 298 wurde anhand der Koloniemorphologie sowie der physiologischen und biochemischen Eigenschaften identifiziert20. Dies wurde durch die PCR-Amplifikation des 16S-rRNA-Gens und die phylogenetische Analyse weiter bestätigt. Das 16S-rRNA-Gen ist der am häufigsten verwendete Genmarker zur Identifizierung von Bakterien bis hin zur Artebene. Das 16S-rRNA-Gensequenz-Alignment von C. balustinum, RTFCP 298 und die phylogenetische Analyse ergaben, dass es maximale Sequenzähnlichkeit mit dem C. balustinum-Stamm WLT (MN317337) aufwies20. Es wird vorgeschlagen, dass die Identifizierung des 16S-rRNA-Gens bei der Diagnose einer C. balustinum-Infektion bei Fischen nützlich sein kann. Chryseobacterium WLT (MN 317337) aus Regenbogenforellen in der Republik Korea zeigte eine Ähnlichkeit von 99,24 % mit anderen Chryseobacterium-Gruppen20. Ebenso weist das 16S-rRNA-Gen von C. scophthalmum, isoliert aus Golden Mahseer TPBLGL 18 (KM822770), eine 99-prozentige Ähnlichkeit mit dem 16S-rRNA-Gen des C. scophthalmum-Stamms LMG 13028T (NR 025386)24 auf.

Ein Mikroverdünnungstest mit Resazurin ergab die niedrigste minimale Hemmkonzentration gegen den Stamm C. balustinum für Oxytetracyclin, Florfenicol und Erythromycin. Aufgrund ihrer weitreichenden Wirksamkeit und der geringeren Schädigung von Fischen setzen die Fischzüchter in Indien häufig Oxytetracyclin, Tetracyclin und Ampicillin zur Bekämpfung bakterieller Krankheiten ein51. Folglich könnte der Einsatz eines dieser drei Antibiotika als potenzielle Kontrollmaßnahme bei einer C. balustinum-Infektion bei Forellen dienen. Frühere Studien haben die natürliche Resistenz von Chryseobacterium spp. dokumentiert. gegenüber einer Untergruppe von Antibiotika, einschließlich Tetracyclinen, Erythromycin, Linezolid, Polymyxinen und Chloramphenicol52. Darüber hinaus haben wir in unserer Untersuchung die antimikrobielle Wirksamkeit von 15 synthetischen neuartigen antimikrobiellen Peptiden (AMPs) gegen C. balustinum bewertet. Bemerkenswerterweise zeigten 5 der 15 AMPs eine bemerkenswerte antimikrobielle Aktivität (8–32 Μg mL−1) gegen das Zielbakterium. Die Anfälligkeit von Peptiden für bakterielle Störungen kann auf ihre kurze Länge zurückgeführt werden, die die Wahrscheinlichkeit erhöht, einzigartige Sequenzen zu besitzen. Da nur eine begrenzte Anzahl von Medikamenten und Chemikalien zur Behandlung von Krankheiten in der Aquakultur zugelassen sind, könnte eine Tierseuche während des Ausbruchs zu erheblichen Verlusten in Fischzuchtbetrieben führen53.

Der molekulare Virulenzmechanismus von Nicht-Modellorganismen wie C. balustinum kann mithilfe von Informationen aus den Virulenzmechanismen von Modellarten besser verstanden werden. In der aktuellen Studie wurden nur wenige der pathogenen Determinanten von C. balustinum in vitro durch vergleichende Forschung an virulenten Kolonietypen wie hämolytischen Tests und Biofilmbildung untersucht. Es wurde beobachtet, dass die hämolytische Aktivität von C. balustinum, wie die von F. columnsare, eine höhere Expression und Erkennung gegenüber dem starken hämolytischen Wirkstoff Triton X-100 (0,2 %) aufweist36. Hämolysin anderer Organismen wurde anhand seiner Fähigkeit identifiziert, Erythrozyten zu lysieren oder die biologische Funktion anderer Zellen zu beeinflussen54. Proteasen können eine wichtige Rolle bei der Bildung von Biofilmen spielen, die die Pathogenität von Bakterien bestimmen55,56. Der Biofilmbildungstest ergab, dass C. balustinum in der Lage war, mit oder ohne Glukose im Medium einen Biofilm zu bilden. Es wird angenommen, dass die biofilmerzeugenden Bakterien der Hauptfaktor für viele opportunistische Infektionen bei Fischen sind und aufgrund ihrer deutlich erhöhten Resistenz (1000-fach) gegen mehrere antimikrobielle Mittel äußerst schwer zu beseitigen sind. Infolgedessen müssen höhere Konzentrationen antimikrobieller Arzneimittel eingesetzt werden, um in Biofilmen etablierte pathogene Mikrobenkonsortien abzutöten oder deren Bildung einzuschränken57.

Mehrere Studien aus Indien berichteten über F. branchiophilum- und F. columnsare-Infektionen bei gezüchteten indischen Großkarpfen (IMCs), Zierfischen und Regenbogenforellen36,58,59,60. Sichtbare klinische Symptome wie Kiemenläsionen sowie kutane Blutungen und Aszites im Peritoneum wurden neben anderen Symptomen auch bei Golden Mahseer registriert, die mit Flavobacterium-Arten infiziert waren4,39,59,61,62. In unserer Studie wurde festgestellt, dass C. balustinum RTFCP 298 im experimentellen Infektionsversuch mäßig pathogen für junge Regenbogenforellen ist, um den Koch-Postulat-Test zu bestätigen, indem Symptome wie Hautnekrose, Verflüssigung, Splenomegalie im subperitonealen Bereich und diffuse Petechien am Auge festgestellt wurden Blutung in der Vorderkammer, Blutung innerer Organe und Aszitesausfluss aus dem Anus. Obwohl der Belastungstest 90 Tage lang durchgeführt wurde, verursachte die Pathogenität von Chryseobacterium RTFCP 298 bei experimentellen Dosen von 106, 107 und 108 KBE ml−1 eine moderate Mortalität bei Regenbogenforellen. Im Allgemeinen ist die Pathogenität von Chryseobacterium bei Zuchtfischen geringer als die der wichtigsten bakteriellen Krankheitserreger (z. B. Flavobacterium spp und Lactococcus garvieae). Obwohl die Pathogenität von Chryseobacterium nicht viel höher ist als die anderer häufiger Krankheitserreger in der Aquakultur, zeigte ein 15-tägiger experimenteller Infektionsversuch an Regenbogenforellen mit einem Durchschnittsgewicht von 20 g durch den Chryseobacterium-Stamm WLT bei 3 × 107 KBE des Bakteriums eine Mortalität von 60 % LD50 des gleichen Stamms wurde zwischen 106 und 107 KBE des Bakteriums gemessen (Jung et al.20). Dieses indische Isolat, Chryseobacterium RTFCP 298, hat einen LD50-Wert von 108 KBE mL−1. In der vorliegenden Studie wurde durch die Reproduktion klinischer Anzeichen des Fortschreitens der Krankheit und die Isolierung von C. balustinum in den Organen der betroffenen Regenbogenforelle der Test von Kochs Hypothesen bestätigt. Der Nachweis einiger Aeromonas-Isolate auf TSA-Platten könnte jedoch mit der möglichen Stressinduktion in einem so langen Belastungstest zusammenhängen.

Die vorliegende Studie untersuchte die histopathologischen Veränderungen im Zusammenhang mit experimentellen Infektionen von C. balustinum bei Regenbogenforellen. Das Kiemengewebe wies verschiedene Veränderungen auf, darunter nekrotische Deformationen, Verschmelzung der primären und sekundären Kiemenlamellen, Hypertrophie, Hyperplasie und Vakuolisierung. Kiemenbakterielle Erkrankungen bei Fischen sind, wie bereits berichtet, durch Lamellenverschmelzung und Lamellenepithelzellhyperplasie gekennzeichnet63. Ähnliche histologische Veränderungen im Kiemengewebe wurden bei Salmoniden4, Golden Mahseer24 und jungen Steinbutten64 beobachtet, die mit C. scophthalmum und anderen Chryseobacterium sp. infiziert waren. Darüber hinaus zeigten andere Organe wie Leber, Auge, Niere und Milz pathologische Veränderungen wie Vakuolisierung, Vergrößerung des Sinusraums, Veränderung der Hepatozyten und des Hepatozytenkerns, Blutsinusveränderungen, vergrößerten Raum zwischen pigmentiertem Epithel und Photorezeptorschicht, Zapfen-Stäbchen-Dystrophie , Blutung, Erweiterung des Bowman-Raums, Ansammlung von Hämosiderin, weißer und roter Pulpa. Daher deuteten klinische Anzeichen und histopathologische Veränderungen darauf hin, dass das Vorliegen der Krankheit bei Regenbogenforellen auf die Infektion mit C. balustinum zurückzuführen war.

Die vorliegende Studie berichtet über die Anfälligkeit des Testisolats C. balustinum gegenüber einer Reihe von von der FDA zugelassenen Antibiotika, die üblicherweise in der Aquakultur eingesetzt werden. Bemerkenswert ist, dass dies der erste Bericht über die Isolierung von C. balustinum im indischen Kontext ist. Die vorliegenden Ergebnisse unterstreichen das Potenzial einer geeigneten Antibiotikabehandlung zur wirksamen Bekämpfung von C. balustinum-Infektionen bei Zuchtforellen. Wichtig ist, dass diese Forschung zur Identifizierung und Bekämpfung der Krankheit in der Regenbogenforellenzucht beiträgt und die Notwendigkeit der Einführung eines regelmäßigen Überwachungs- und Inspektionssystems unterstreicht. Daher könnte die Analyse infizierter Proben aus Forellenfarmen dazu beitragen, die Ausbreitung von C. balustinum und anderen Krankheiten in Aquakultur-Produktionseinheiten zu verhindern.

Die Nukleotidsequenz (16S rRNA) von Chryseobacterium balustinum RTFCP 298 wurde der Genbank NCBI vorgelegt und ist unter der Zugangsnummer OP604185 der Öffentlichkeit zugänglich. Alle in der Studie generierten Daten sind in diesem Artikel enthalten.

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Die Autoren danken dem Indian Council of Agricultural Research, Neu-Delhi, Indien, für die Bereitstellung von Laboreinrichtungen zur Durchführung dieser Forschungsarbeit.

Diese Forschung wird durch externe Mittel des Indian Council of Agricultural Research im Rahmen des All India Network Project on Fish Health (AINP-FH) unterstützt.

ICAR-Direktion für Kaltwasserfischereiforschung (ICAR-DCFR), Bhimtal, Nainital, Uttarakhand, 263136, Indien

Sumanta Kumar Mallik, Richa Pathak, Neetu Shahi, Krishna Kala, Suresh Chandra, Partha Das, Bhupendra Singh, Mohan Singh, Ritesh Shantilal Tandel, Debajit Sarma und Pramod Kumar Pandey

ICAR-Indian Agricultural Research Institute, Gauriakarma, Hazaribagh, Jharkhand, 825405, Indien

Abhay Kumar Giri

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SKM: Konzeption, Durchführung der Recherche und Erstellung des endgültigen Manuskripts. RP: führte die Recherche durch und verfasste das Originalmanuskript. NS: die Daten analysiert und validiert. KK, SC, PD, BS, MS: Proben gesammelt und Forschung durchgeführt. AKG, RST: analysierte die Daten. PKP: betreute und redigierte das Manuskript. Alle Co-Autoren haben die redigierte Fassung des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden.

Korrespondenz mit Sumanta Kumar Mallik oder Pramod Kumar Pandey.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mallik, SK, Pathak, R., Shahi, N. et al. Pathologische Analyse und antimikrobielle Empfindlichkeit von Chryseobacterium balustinum RTFCP 298, isoliert aus der erkrankten Regenbogenforelle Oncorhynchus mykiss. Sci Rep 13, 13268 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40028-5

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Eingegangen: 06. April 2023

Angenommen: 03. August 2023

Veröffentlicht: 15. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40028-5

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