Metabolomische Analyse der viszeralen Leishmaniose anhand des Urins von Goldhamstern

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 304 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Leishmaniose ist eine der am meisten vernachlässigten Tropenkrankheiten und verbreitet sich vor allem in armen Regionen der Welt. Obwohl sich viele Studien auf die Reaktion des Wirts auf die Invasion von Leishmanien konzentrierten, ist relativ wenig über die komplexen Prozesse auf Stoffwechselebene bekannt, insbesondere über die Stoffwechselveränderungen in den infizierten Wirten.

In dieser Studie führten wir eine Metabolomikanalyse des Urins von Goldhamstern in Gegenwart oder Abwesenheit einer viszeralen Leishmaniose (VL) durch, wobei wir das hochauflösende Tandem-Massenspektrometer (HRMS) des Ultra-Performance Liquid Chromatography (UPLC)-Systems verwendeten. Die Stoffwechseleigenschaften von Urinproben wurden zusammen mit der histopathologischen Veränderung und der Parasitenbelastung von Leber- und Milzgewebe 4 bzw. 12 Wochen nach der Infektion (WPI) festgestellt.

Der Aminosäurestoffwechsel war in beiden Stadien der VL-Progression stark beeinträchtigt. Mittlerweile gab es auch unterschiedliche Stoffwechselmerkmale in verschiedenen Stadien. Bei einem WPI von 4 waren die signifikant betroffenen Stoffwechselwege der Alanin-, Aspartat- und Glutamatstoffwechsel, der Pentosephosphatweg (PPP), der Histidinstoffwechsel, der Tryptophanstoffwechsel und der Tyrosinstoffwechsel. Bei 12 WPI konzentrierten sich die deutlich angereicherten Stoffwechselwege fast auf den Aminosäurestoffwechsel, einschließlich Tyrosinstoffwechsel, Taurin- und Hypotaurinstoffwechsel sowie Tryptophanstoffwechsel. Die fehlregulierten Metaboliten und Stoffwechselwege waren bei 12 WPI offensichtlich geringer als bei 4 WPI. Darüber hinaus wurden sieben Metaboliten, die in beiden Stadien fehlreguliert waren, durch partielle Kleinste-Quadrate-Diskriminanzanalyse (PLS-DA) und Receiver-Operating-Characteristic-Tests (ROC) auf diagnostisches Potenzial untersucht. Die Kombination dieser Metaboliten als potenzielles Biomarker-Panel zeigte eine zufriedenstellende Leistung bei der Unterscheidung von Infektionsgruppen von Kontrollgruppen sowie zwischen verschiedenen Infektionsstadien.

Unsere Ergebnisse könnten wertvolle Informationen für das weitere Verständnis der Wirtsreaktion auf eine Leishmania-Infektion unter dem Aspekt des Urinmetaboloms liefern. Das vorgeschlagene Urin-Biomarker-Panel könnte bei der Entwicklung eines neuartigen Ansatzes für die Diagnose und Prognose von VL helfen.

Die durch Sandmücken übertragene Parasitose Leishmaniose, eine der am meisten vernachlässigten Tropenkrankheiten, wird durch über 20 Parasitenarten der Gattung Leishmania verursacht und ist in etwa 97 Ländern weltweit verbreitet [1]. Schätzungsweise 0,7–1 Million neue Fälle von Leishmaniose pro Jahr werden gemeldet [2]. Die Manifestationen der Leishmaniose umfassen hauptsächlich VL, kutane Leishmaniose (CL) und mukokutane Leishmaniose (MCL). VL ist die schwerste Form und kann tödlich sein, wenn sie nicht rechtzeitig behandelt wird. In den letzten Jahren konzentrierten sich VL-Fälle auf Ostafrika, den indischen Subkontinent und Brasilien, und 83 % dieser Fälle wurden in Brasilien, Äthiopien, Indien, Südsudan und Sudan gemeldet [1, 3]. In China wurde anerkannt, dass VL die einzige autochthone Form der Leishmaniose ist, die hauptsächlich sporadisch in lokalen Gebieten der Provinzen Xinjiang, Gansu und Sichuan verbreitet ist und das Endemiegebiet allmählich zunimmt [4]. Durch die vorherige Diskriminierung und phylogenetische Analyse wurden Leishmania donovani und L. infantum als die Hauptverursacher der chinesischen VL bestätigt [5, 6].

Es besteht kein Zweifel, dass eine frühzeitige Diagnose für die epidemiologische Untersuchung und Bekämpfung der Leishmaniose sowie für deren Behandlung von entscheidender Bedeutung ist. Angesichts der sehr unterschiedlichen Reservoirwirte in natürlichen Epidemieherden und der komplexen Mobilität der Bevölkerung sollte eine ideale Nachweis-/Diagnosemethode außerdem einfach und schnell sein und für Hochdurchsatz-Screening geeignet sein. Es wurden Laboruntersuchungsmethoden für VL untersucht, darunter serologische Tests, immunologische Tests und PCR-basierte Methoden. Einige davon, wie beispielsweise der RK39-Messstab, wurden kommerziell eingesetzt. Aufgrund der Sensitivität und Spezifität gibt es derzeit keine andere Methode zur endgültigen Diagnose von VL als invasive Biopsien von Milz, Leber, Knochenmark und Lymphknoten. Insbesondere die Milzaspiration ist immer noch der aktuelle Goldstandard [7]. Diese lebensbedrohlichen invasiven Methoden erfordern relativ hohe operative Fähigkeiten und eignen sich daher nicht für eine groß angelegte Popularisierung oder Feldforschung [8]. Daher ist die Entwicklung einer neuen schnellen und effektiven Diagnosemethode weiterhin notwendig. Zur Behandlung werden seit langem fünfwertiges Antimon (SbV), Amphotericin B und Miltefosin zur VL-Therapie eingesetzt. Die ständig wachsenden Herausforderungen in Bezug auf Arzneimittelresistenz, Nebenwirkungen und Toxizität haben die Wirksamkeit der Chemotherapie bei VL untergraben [9]. Es besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuer spezifischer Medikamente, um die aktuelle Situation zu verbessern. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Verbesserungen in der Diagnose oder Pharmakotherapie von VL im Wesentlichen auf einem umfassenden Wissen über die Mechanismen beruhen, die der Leishmaniose zugrunde liegen.

Durch umfangreiche Studien konnten umfassendere Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen der Leishmaniose-Pathogenese gewonnen werden [10, 11]. In den letzten Jahren wurden mit der Einführung von Metabolomics-Ansätzen einige Entdeckungen im molekularen Stoffwechsel von Leishmanien gemacht. Die metabolischen Eigenschaften verschiedener Stadien oder verschiedener Arten von Leishmania wurden beschrieben [12,13,14] und es wurde festgestellt, dass das metabolische Profil von Wirtszellen während der Leishmania-Infektion beeinflusst wird [15,16,17]. Darüber hinaus wurde über durch Arzneimittel (SbV oder Miltefosin) induzierte Abweichungen im Metabolom berichtet [18, 19] sowie über metabolische Analysen des Mechanismus der Arzneimittelresistenz bei Leishmanien [20,21,22]. Diese Studien haben unser aktuelles Wissen über die Reaktion des Wirts auf die Leishmania-Invasion erweitert. Andererseits haben auf der Massenspektrometrie basierende Metabolomics-Methoden durch vergleichende statistische Analysen erfasster Datensätze einzigartige Vorteile bei der Suche nach Indikatoren für bestimmte Zustände, was in Studien zur Suche nach Biomarkern für eine Vielzahl von Krankheiten gut nachgewiesen und angewendet wurde [23]. Für Leishmaniose wurden einige Metaboliten ausgewählt und bewertet, die prädiktiv und prognostisch für die Behandlung von Leishmaniose waren [24]. Darüber hinaus untersuchte unsere aktuelle Studie die Stoffwechselveränderungen im Serum über eine VL-Serie mit vier Zeitpunkten. Stoffwechselwege im Zusammenhang mit Glycerophospholipiden (GPLs) wurden erheblich beeinträchtigt, wobei Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE) während der VL hochreguliert wurden [25]. Insgesamt stellen Metabolomics-Ansätze durch die direkte Untersuchung von Veränderungen in kleinen Molekülen während einer Infektion ein vielversprechendes Mittel dar, um das Zusammenspiel von Wirt und Leishmania besser zu verstehen und neue Ziele für die Diagnose und Prognose von Leishmaniose zu entdecken. Dennoch ist das derzeitige Verständnis der Wirt-Leishmanien-Interaktion unter metabolischen Aspekten noch unzureichend [26].

Da Urin der Probentyp ist, der die meisten Stoffwechselendprodukte enthält, können Veränderungen im Urin die Störung vieler biochemischer Wege im Körper widerspiegeln [27, 28]. Darüber hinaus ist Urin aufgrund seiner leichteren Verfügbarkeit und geringeren Komplexität der Bestandteile als andere Bioproben ein idealer Probentyp für Studien und Tests [29]. Im Forschungsgebiet Leishmanien ist der Syrische Goldhamster (Mesocricetus auratus) sehr infektionsanfällig und kann das Fortschreiten der VL gut simulieren; Daher gilt es als das beste experimentelle Modell für pathologische Studien [30]. In dieser Studie führten wir eine Metabolomik-Analyse des Urins von Goldhamstern in Gegenwart oder Abwesenheit von VL durch, basierend auf dem Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-System (UPLC), einem hochauflösenden Tandem-Massenspektrometer (HRMS) sowie univariaten und multivariaten statistischen Methoden Wird verwendet, um den Datensatz zu analysieren, der sowohl im frühen als auch im späten Stadium der VL erfasst wurde. Die Erkenntnisse zu den Eigenschaften des Metaboloms könnten unser Verständnis der Wirtsreaktion auf das Fortschreiten der VL erleichtern. Darüber hinaus wird erwartet, dass der ausgewählte potenzielle Biomarker zur Entwicklung neuartiger Diagnosetechniken und zur Prozessüberwachung von VL beiträgt.

Die Tierversuche in dieser Studie wurden von der Medizinischen Ethikkommission der Abteilung für medizinisches Management der Universität Sichuan genehmigt und stehen unter deren Aufsicht. Bei Operationen, die bei Tieren Schmerzen verursachen könnten, wurde vor anderen Eingriffen eine Äther-Inhalationsnarkose verabreicht. Die Ethikbescheinigung für Tierversuche und ihre übersetzte Version finden Sie in den ergänzenden Materialien.

Der in dieser Studie verwendete Leishmania-Stamm wurde in einer früheren Studie als L. infantum identifiziert [25]. Der Stamm wurde routinemäßig bei Hamstern konserviert. Vor den Experimenten wurde der Leishmania-Stamm isoliert und in modifiziertem M199-Flüssigmedium (enthaltend 15 % fötales Rinderserum und 20 % steriles defibriniertes Kaninchenblut) hermetisch bei 26 °C unter Schütteln bei 80 U/min kultiviert. Metazyklische Promastigoten wurden konzentriert und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4 resuspendiert, die für die Tierinfektion vorbereitet war.

Insgesamt 24 2 Monate alte weibliche Goldhamster (M. auratus) wurden zufällig in Kontroll- und Infektionsgruppen aufgeteilt (n = 12 für jede Gruppe). Alle Hamster wurden in einem Versuchstierraum gezüchtet und mit sterilem Futter und Wasser nach Belieben versorgt. Vor formalen Experimenten wurden die Tiere vier Wochen lang gezüchtet, um Stressreaktionen abzuschwächen.

Ähnlich wie bei unserem zuvor etablierten Modell wurden die gruppierten Hamster einer Impfung unterzogen. Nach der Zählung wurde jedem Hamster der Infektionsgruppe 1 ml PBS-Inokulum mit 2,7 × 107 L. infantum-Promastigoten intraperitoneal injiziert [25]. In der Kontrollgruppe wurden die Hamster separat nur mit 1 ml PBS behandelt.

Sowohl beim 4. als auch beim 12. WPI wurden in jeder Gruppe acht Urinproben zur Metabolomik-Erkennung gesammelt. Um Fehler auszuschließen, die durch den zirkadianen Rhythmus von Säugetieren verursacht werden [31], wurde mit der Probenahme zur gleichen Tageszeit begonnen und über einen Zeitraum von 6 Stunden in Stoffwechselkäfigen durchgeführt. Vor der Entnahme wurde über Nacht gefastet und ausreichend Trinkwasser verabreicht. Die Urinproben wurden sofort bis zur metabolomischen Erkennung bei –80 °C gelagert.

In jeder Gruppe wurden die anderen vier Hamster zur Bestätigung der Infektion und zur pathologischen Beobachtung getötet. Zwei Hamster aus der Infektions- oder Kontrollgruppe wurden bei 4 bzw. 12 WPI getötet. Das Leber- und Milzgewebe wurde gesammelt und 4 Wochen lang in 10 % Paraform (Solarbio, Peking, China) fixiert, gefolgt von einem Verfahren, bei dem Wasser in fixierten Geweben schrittweise durch Ethanol ersetzt wurde. Anschließend wurde Xylol nach und nach durch Ethanol ersetzt und die Schnitte schließlich ausreichend mit flüssigem Paraffin gesättigt. Schließlich wurden 3 μm große Gewebeschnitte mit Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Reagenz (Solarbio, Peking, China) gefärbt. Das Fortschreiten der Infektion wurde durch mikroskopische Untersuchung beurteilt.

Parallel dazu wurden die Leber- und Milzgewebe gewogen und 50 mg jeder Probe in 1 ml PBS homogenisiert. Anschließend wurde die gesamte DNA mit dem TIANamp Genomic DNA Kit (TianGen Biotech, Peking, China) gemäß dem Handbuch extrahiert. Für jede Probe wurde die extrahierte DNA in 80 μl RNase-freiem ddH2O verdünnt. Für die Standardkurve der Leishmania-Belastung wurden die Parasiten in einem zehnfachen Gradienten von 106 zu 1 verdünnt. Die Gesamt-DNA wurde extrahiert und in 80 μl RNase-freiem ddH2O gelagert. Zur Erkennung der Parasitenbelastung wurde ein TaqMan-Sondenfluoreszenz-Echtzeit-PCR-Schema durchgeführt. Das Primerpaar und die Sonde wurden in früheren Untersuchungen beschrieben [32]. Die PCR-Bedingungen sind in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1 aufgeführt. PCR-Programme wurden auf dem Mastercycler ep realplex 2 (Eppendorf, Deutschland) durchgeführt.

Der metabolomische Nachweis von Urinproben wurde im Labor des Beijing Genomics Institute (BGI) auf Basis der Plattform des Waters 2D Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)-Systems Tandem ThermoFisher Q Exactive High Resolution Mass Spectrometer (HRMS) durchgeführt.

Der detaillierte Prozess der Probenvorbehandlung und die Komponente der inneren Standards finden Sie in der Zusatzdatei 2. Die chromatographische Trennung wurde auf einer BEH C18-Säule (1,7 μm, 2,1 × 100 mm, Waters, USA) durchgeführt. Die mobile Phase des positiven Elektrospray-Ionisationsmodus (ESI+) bestand aus Lösung A (Wasser mit 0,1 % Ameisensäure) und Lösung B (Methanol mit 0,1 % Ameisensäure). Die mobile Phase des negativen Elektrospray-Ionisationsmodus (ESI−) bestand aus Lösung A (Wasser mit 10 mM Ammoniumformiat) und Lösung B (95 % Ethanol mit 10 mM Ammoniumformiat). Das Gradientenelutionsverfahren war wie folgt: 0–1 Minute, 2 % Lösung B; 1–9 Min., 2–98 % Lösung B; 9–12 Min., 98 %ige Lösung B; 12–12,1 Min., 98–2 %ige Lösung B; 12,1–15 min, 2 %ige Lösung B. Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,35 ml/min, die Säulentemperatur betrug 45 °C und das Probenladevolumen betrug 5 μl.

Die MS- und MS2-Daten wurden mit Scan-Masse/Kern-Verhältnissen im Bereich von 70 bis 1050 erhalten. Die Injektionszeiten des primären und sekundären Scans betrugen 100 bzw. 50 ms. Der abgestufte NCE betrug 20, 40 und 60 eV. Die Hüllgasdurchflussrate von ESI betrug 40 und die Hilfsgasdurchflussrate betrug 10. Die Sprühspannung betrug 3,80 für ESI+ und 3,20 für ESI−. Die Kapillartemperatur betrug 320 °C und die Temperatur der Zusatzgasheizung betrug 350 °C.

Die Rohdaten wurden hauptsächlich zur Vorverarbeitung in Compound Discoverer 3.1 (Thermo Fisher Scientific, USA) importiert. Es wurden Peakpicking, Ausrichtung und Extraktion, Korrektur der Retentionszeit, Adduktionsverschmelzung, Füllen fehlender Werte, Markieren von Hintergrundpeaks, Normalisierung, Entfaltung und Identifizierung durchgeführt. Nach der Vorverarbeitung wurden die Originaldaten in das R-basierte Softwarepaket metaX [33] übertragen, um Metabolomics-Analysen, statistische Analysen und Metabolitenanmerkungen durchzuführen. Nach probabilistischer Quotientennormalisierung (PQN) und qualitätskontrollbasierter robuster LOESS-Signalkorrektur (QC-RLSC) wurden Ionenpeaks mit einem Variationskoeffizienten (CV) in QC-Proben > 30 % aus nachgeschalteten Analysen eliminiert. Anschließend wurden die detektierten Ionen durch Vergleich mit Standardsubstanzen und durch Kombination von Referenzen selbst erstellter Datenbanken, kommerzieller Datenbanken und Open-Access-Bibliotheken identifiziert, darunter die BGI Library, mzCloud Mass Spectral Library, Chemspider, Human Metabolome Database (HMDB), Kyoto Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG) und Lipidkarten.

Nach der Ionenidentifizierung wurden die vorbehandelten Daten standardmäßigen statistischen Analysen unterzogen. Vor univariaten und multivariaten statistischen Analysen wurden die Originaldaten durch Log2-Konvertierung und Pareto-Skalierung normalisiert. Anschließend wurde die Hauptkomponentenanalyse (PCA) eingesetzt, um Ähnlichkeiten und Unterschiede innerhalb und zwischen Stichprobengruppen zu beobachten und die Ausreißer zu bewerten. Student-T-Test, Fold Change (FC)-Berechnung und PLS-DA wurden durchgeführt, um Differenzionen zwischen der Infektions- und der Kontrollgruppe zu identifizieren. Durch die Berechnung der FC-Werte, der durch die Falscherkennungsrate (FDR) angepassten P-Werte und der Variablenbedeutung für die Projektion (VIP) wurden Metaboliten, die gleichzeitig FC ≥ 1,2 oder ≤ 0,8333, P < 0,05 und VIP ≥ 1,0 erfüllten, als differenzielle Metaboliten erkannt.

Um die Genauigkeit der Ergebnisse zu maximieren, wurden nur Ionen ausgewählt und in den Analysen dieser Studie verwendet, deren MS2-Daten vollständig mit den Bibliotheken übereinstimmten. Metaboliten wurden anhand ihrer Kategorieinformationen auf HMDB klassifiziert. Die Pathway-Analysen wurden mit MetaboAnalyst 5.0 durchgeführt [34]. Die Leistung potenzieller Biomarker zur Diagnose viszeraler Leishmaniose wurde durch den ROC-Test bewertet. Je näher die Fläche unter der Kurve (AUC) bei 1,0 lag, desto besser war die Wirksamkeit der prädiktiven Diagnose.

Nach der Infektion gab es bei 4 WPI keine signifikanten Unterschiede im Verhalten der Hamster zwischen der Kontroll- und der Infektionsgruppe. Bei 12 WPI wurden bei den Hamstern der Infektionsgruppe Hypersomnie und verminderte Aktivität beobachtet.

Die Mikroskopie der Gewebeschnitte zeigte das Fortschreiten der VL in der Infektionsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 1, 2). Bei 4 WPI wurde eine deutliche Infiltration von Entzündungszellen in Leberschnitten beobachtet, während die Veränderungen in der Milz unauffällig waren. Als die VL einen Wert von 12 WPI erreichte, begannen sporadische Granulome in den Leberschnitten aufzutreten. In der Milz wurde eine ausgedehnte weiße Pulpa beobachtet, in der diffuse Amastigoten gefunden wurden. Der Infektionsstatus wurde auch durch Echtzeit-PCR bestimmt (die Echtzeit-PCR-Standardkurve ist in der Zusatzdatei 3: Abb. S1 dargestellt), wobei die Parasitenlast einen steigenden Trend von 4 auf 12 WPI zeigte (Abb. 3). was im Allgemeinen mit den pathologischen Ergebnissen übereinstimmt. Diese Ergebnisse stimmten auch mit unserer vorherigen Studie überein (25), die bewies, dass die pathologischen Merkmale des VL-Tiermodells stabil und repetitiv waren.

H&E-gefärbte pathologische Lebergewebeschnitte. A Beobachtete Gewebeschnitte bei 400-facher Vergrößerung. B Beobachtete Gewebeschnitte bei 1000-facher Vergrößerung. Die Diagramme in jeder Spalte von links nach rechts stellen Kontrollgruppen dar, 4 bzw. 12 WPI, wie oben markiert. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe wurde die Infiltration von Entzündungszellen bei 4 WPI beobachtet. Signifikante sporadische Granulome wurden bei 12 WPI beobachtet, gekennzeichnet durch gelbe Fünfecke. Leishmania amastigotes wurden durch gelbe Pfeile gekennzeichnet. Balken: (A) 60 μm; (B) 24 μm

H&E-gefärbte pathologische Schnitte von Milzgewebe. A Milzgewebeschnitte bei 400-facher Vergrößerung. B Milzgewebeschnitte bei 1000-facher Vergrößerung. Die Diagramme in jeder Spalte von links nach rechts stellen Kontrollgruppen dar, 4 bzw. 12 WPI, wie oben in den Diagrammen markiert. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe waren die Veränderungen nicht so offensichtlich, es konnte jedoch ein Trend zur Makrophagenaggregation festgestellt werden. Leishmania-Amastigoten-ähnliche Flecken waren in der ausgedehnten weißen Pulpa bei 12 WPI offensichtlich, gekennzeichnet durch gelbe Pfeile. Balken: (A) 60 μm; (B) 24 μm

Parasitenbelastung in Leber und Milz. Leishmanienbelastung in Leber und Milz bei 4 bzw. 12 WPI (2 Hamster aus der Infektions- oder Kontrollgruppe wurden zu jedem Zeitpunkt getötet und jede Probe war dreifach vorhanden)

Die Basispeakchromatogramme (BPCs) der QC-Proben überlappten stark und die PCA-Diagramme der QC-Proben waren stark konzentriert. Diese Ergebnisse zeigten die Wiederholbarkeit und Stabilität des LC-MS-Systems über den Testzeitraum (Zusatzdatei 4: Abb. S2).

Bei 4 oder 12 WPI wurden acht Urinproben aus der Infektions- bzw. Kontrollgruppe einer Metabolitenanalyse unterzogen. Nach der Vorverarbeitung der Rohdaten, der Datenfiltration und der Annotation der Metaboliten wurden insgesamt 18.201 Ionen identifiziert, davon 11.038 im ESI+-Modus und 7163 im ESI−-Modus (Tabelle 1A). Diese Ionen deckten die Identifizierungssicherheitsniveaus der Stufen 1 bis 5 ab [35]. Um die Genauigkeit und Präzision der Ergebnisse zu gewährleisten, wurden in dieser Studie nur die Metaboliten für Metabolomics-Analysen und -Interpretationen ausgewählt, die über MS2-Bibliotheken interpretiert wurden. Da PCA weder die Infektionsgruppe von der Kontrollgruppe noch die Infektionsgruppe zu unterschiedlichen Zeitpunkten unterscheiden kann (Zusatzdatei 4: Abb. S2B), wurde dann überwachtes PLS-DA verwendet, um die verschiedenen Metaboliten zwischen verschiedenen Gruppen weiter zu identifizieren (Abb. 4). im ESI+-Modus und Zusatzdatei 5: Abb. S3 im ESI−-Modus). Abbildung 4A, B zeigt, dass die Infektionsgruppen bei 4 WPI und 12 WPI deutlich von den Kontrollgruppen getrennt waren und die Infektionsgruppen bei 4 und 12 WPI ebenfalls in Abb. 4C unterteilt waren. Für Abb. 4A, R2 = 0,99, Q2 = 0,82; für Abb. 4B, R2 = 0,99, Q2 = 0,58; für Abb. 4C, R2 = 0,99, Q2 = 0,60.

PLS-DA-Vergleichsdiagramme zwischen verschiedenen Gruppen im ESI+-Modus. Im PLS-DA-Diagramm repräsentiert jeder Datenpunkt eine Urinprobe. Die Ergebnisse wurden mit dem R-basierten Paket metaX berechnet. Eine Kontrolle vs. Infektion bei 4 WPI. R2 = 0,99, Q2 = 0,82. B Kontrolle vs. Infektion bei 12 WPI. R2 = 0,99, Q2 = 0,58. C 4 WPI vs. 12 WPI der Infektionsgruppe. R2 = 0,99, Q2 = 0,60

Wie Tabelle 1B zeigt, gab es nach den voreingestellten Kriterien FC ≥ 1,2 oder ≤ 0,8333, FDR-angepasster p < 0,05 und VIP ≥ 1,0 bei 4 WPI 90 unterschiedliche Metaboliten zwischen der Infektions- und der Kontrollgruppe, von denen 57 im ESI + lagen Modus und 33 waren im ESI-Modus. Bei 12 WPI wurden 47 Differenzialmetaboliten im ESI+-Modus und 18 Differenzialmetaboliten im ESI−-Modus identifiziert. Die detaillierten Informationen zu den gesamten Differenzialmetaboliten sind in der Zusatzdatei 6 aufgeführt. Bemerkenswerterweise variierten 12 Metaboliten sowohl bei 4 als auch bei 12 WPI (Abb. 5A, B), davon 11 im ESI + -Modus und die anderen im ESI− -Modus.

Anzahl und Verteilung der Differenzialmetaboliten bei 4 WPI und 12 WPI. Die gesamten differenziellen Metaboliten zu verschiedenen Zeitpunkten wurden als Venn-Diagramm online basierend auf „Venny 2.1“ visualisiert. A Ergebnisse im ESI+-Modus. Elf Metaboliten wurden bei 4 WPI und 12 WPI geteilt. B Ergebnisse im ESI-Modus. Ein Metabolit wurde bei 4 WPI und 12 WPI geteilt

Die Differenzialmetaboliten wurden nach ihren Strukturmerkmalen kategorisiert. Die Nomenklatur bezog sich auf HMDB. Insgesamt wurden neun verschiedene Unterklassen von Verbindungen identifiziert, darunter organische Säuren und Derivate, organoheterozyklische Verbindungen, organische Sauerstoffverbindungen, Benzenoide, Lipide und lipidähnliche Moleküle, Phenylpropanoide und Polyketide, organische Stickstoffverbindungen, Peptide, Nukleoside, Nukleotide und Analoga usw andere nicht klassifizierte Metaboliten. Durch Zählen der unterschiedlichen Profile der Anzahl dieser unterschiedlichen Metaboliten wurden zwischen 4 und 12 WPI ermittelt (Abb. 6). Die organischen Säuren und Derivate waren mit 4 WPI vorherrschend, gefolgt von organoheterozyklischen Verbindungen und organischen Sauerstoffverbindungen. Bei 12 WPI nahm die Anzahl dieser drei Arten von Verbindungen ab, während Lipide und lipidähnliche Moleküle zunahmen.

Kategorien und Anzahl der Differenzialmetaboliten bei 4 WPI und 12 WPI. Die differenziellen Metaboliten wurden nach ihren Strukturmerkmalen und den Metabolitenkategorien gemäß HMDB kategorisiert. Blaue Balken stehen für 4 WPI und grüne Balken für 12 WPI

Die differenziellen Metaboliten wurden entsprechend ihren Änderungsmustern hierarchisch gruppiert und dann als Heatmaps visualisiert (Abb. 7 im ESI + -Modus und Zusatzdatei 7: Abb. S4 im ESI−-Modus). Bei 4 WPI waren 61 Differenzialmetaboliten hochreguliert, während 29 herunterreguliert waren, wobei fast alle organischen Säuren und Derivate sowie organischen Sauerstoffverbindungen hochreguliert waren. Bei 12 WPI waren 29 Differenzialmetaboliten hochreguliert, während 36 herunterreguliert waren, wobei die organischen Säuren und Derivate tendenziell hochreguliert waren, während Lipide und lipidähnliche Moleküle herunterreguliert waren.

Heatmaps von Differenzmetaboliten bei 4 WPI und 12 WPI im ESI+-Modus. Die differenziellen Metaboliten wurden entsprechend ihrer Änderungsmuster hierarchisch gruppiert und dann als Heatmaps visualisiert. A Ergebnisse bei 4 WPI im ESI+-Modus. B Ergebnisse bei 12 WPI im ESI+-Modus. Rote Balken oben auf jeder Karte zeigen die Kontrollgruppe und grüne Balken die Infektionsgruppe an. Metaboliten werden durch Reihen dargestellt. Die Farben Rotbraun und Blau zeigen die erhöhte bzw. verringerte Metabolitenintensität an

Diese Ergebnisse zeigten, dass sich das Stoffwechselprofil der Infektionsgruppe, einschließlich der Art, Anzahl und Intensität der unterschiedlichen Metaboliten, bei 4 und 12 WPI signifikant veränderte.

Die Ergebnisse der Signalweganalyse sind in Abb. 8 dargestellt. Bei 4 WPI umfassten die signifikant betroffenen Stoffwechselwege hauptsächlich den Alanin-, Aspartat- und Glutamatstoffwechsel, den Pentosephosphatweg, den Glyoxylat- und Dicarboxylatstoffwechsel, den Purinstoffwechsel, den Histidinstoffwechsel, den Tryptophanstoffwechsel und Tyrosin Stoffwechsel. Bei 12 WPI war die Anzahl fehlregulierter Stoffwechselwege geringer als bei 4 WPI. Der Tyrosinstoffwechsel, der Taurin- und Hypotaurinstoffwechsel sowie der Tryptophanstoffwechsel waren die deutlich betroffenen Stoffwechselwege. Informationen zu differenziellen Metaboliten, die an einigen fehlregulierten Signalwegen beteiligt sind, sind in Tabelle 2 aufgeführt. Detaillierte Informationen zum Übereinstimmungsstatus jedes fehlregulierten Signalwegs sind in der Zusatzdatei 8 aufgeführt.

Dysregulierte Bahnen bei 4 WPI und 12 WPI. Die Pfadanalyse wurde mit MetaboAnalyst 5.0 durchgeführt. Je tiefer die Farbe, desto kleiner ist der p-Wert. Je größer die Blasengröße, desto höher die Auswirkung auf den Pfad. A Dysregulierte Bahnen bei 4 WPI. B Dysregulierte Bahnen bei 12 WPI

Durch univariate und multivariate Analysen variierten 12 Metaboliten sowohl bei 4 als auch bei 12 WPI und wurden als alternative Biomarker für die anschließende Bewertung ausgewählt. Durch weitere univariate ROC-Tests hatten 7 der 12 Metaboliten einen AUROC > 0,8 (Tabelle 3), was eine relativ zufriedenstellende Leistung bei der Unterscheidung zwischen der Infektionsgruppe und der Kontrollgruppe zeigte. Daher wurden die sieben Metaboliten als potenzielles Biomarker-Panel für die VL-Diagnose getestet.

Die Spezifität und Sensitivität des Biomarker-Panels beim Nachweis von VL wurden dann durch ROC-Kurvenanalyse bewertet. Bei der Identifizierung der Infektionsgruppe bei 4 oder 12 WPI waren die Sensitivität und Spezifität sehr hoch, da die AUROCs fast 1 betrugen (Abb. 9A, B). Darüber hinaus war die Leistung des Biomarker-Panels auch bei der Unterscheidung von Infektionsgruppen zwischen 4 und 12 WPI zufriedenstellend, da der AUROC 0,989 mit einem 95 %-Konfidenzintervall von 0,831 bis 1 betrug (Abb. 9C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass das ausgewählte Biomarker-Panel das Potenzial für die VL-Diagnose und Verlaufsüberwachung hat. Die Heatmaps in Abb. 9D zeigten die Ionenstärkeänderungen der sieben potenziellen Biomarker bei 4 WPI und 12 WPI.

Heatmaps und ROC-Kurve zur Beurteilung des diagnostischen Potenzials des ausgewählten Biomarker-Panels. Je näher die AUC bei 1,0 lag, desto besser war die Wirksamkeit der prädiktiven Diagnose. Eine ROC-Kurve des Biomarker-Panels bei 4 WPI. B ROC-Kurve des Biomarker-Panels bei 12 WPI. C ROC-Kurve des Biomarker-Panels für 4 WPI vs. 12 WPI. D Änderungen der Ionenstärke der sieben potenziellen Biomarker bei 4 WPI und 12 WPI wurden als Heatmaps visualisiert. Jede Zeile in den Heatmaps bei 4 WPI und 12 WPI entsprach derselben Verbindungs-ID und demselben Namen auf der rechten Seite

Gemäß den kategorisierten Ergebnissen der Differenzialmetaboliten und Heatmaps (Abb. 6, 7) stellten wir fest, dass die organischen Säuren und Derivate einen erheblichen Teil der Differenzialmetaboliten ausmachten, insbesondere fast alle organischen Säuren und Derivate sowie organischen Sauerstoffverbindungen wurden auf 4 WPI hochreguliert. Unterdessen zeigten die Anreicherungsanalysen der Stoffwechselwege, dass einige Aminosäure-Stoffwechselwege bei 4 WPI und 12 WPI am stärksten beeinträchtigt waren, darunter der Alanin-, Aspartat- und Glutamat-Stoffwechsel, der Taurin- und Hypotaurin-Stoffwechsel, der Tryptophan-Stoffwechsel und der Tyrosin-Stoffwechsel. Dies spiegelte eine bemerkenswerte Anomalie im Aminosäurestoffwechsel der infizierten Hamster wider. Laut unserer früheren Forschung an Leishmania-Hamstermodellen [25] war 4 WPI noch ein relativ früheres Stadium in der gesamten Infektionsperiode, in dem sich die Parasiten schnell vermehrten. Leishmania hat in der frühen Wachstumsphase einen enormen Energiebedarf und Aminosäuren sind eine wichtige Kohlenstoffquelle für Leishmania. Obwohl Leishmania einige Aminosäuren de novo synthetisieren kann, sind viele von ihnen auxotrophe [36] und müssen aus der Umgebung des Wirts gewonnen werden. Dies könnte die Ursache für die Störung des Aminosäurestoffwechsels im Wirt sein. Der Aminosäurestoffwechsel findet hauptsächlich in der Leber statt, und in dieser Studie kam es gemäß den Ergebnissen pathologischer Schnitte und Echtzeit-PCR zu einer Parasitenanreicherung in der Leber bei 4 WPI. In Kombination mit unserer aktuellen Studie zur Serummetabolomik [25] haben wir herausgefunden, dass die Anreicherung von Leishmanien in der Leber in einem frühen Stadium zu einer Schädigung der Leber führen und den Energiestoffwechsel des Wirts, insbesondere den Lipid- und Aminosäurestoffwechsel, deutlich stören kann.

Die Anzahl der identifizierten Differenzialmetaboliten und die Signalweganalyse zeigten, dass die Stoffwechselstörung bei 12 WPI im Vergleich zu 4 WPI offensichtlich geringer war (Tabelle 1; Abb. 8). In unserem VL-Goldhamster-Modell ist 12 WPI im Vergleich zu 4 WPI die mittlere bis späte Periode, in der mehr Amastigoten und Granulome in viszeralen Organen beobachtet werden konnten (Abb. 1, 2). Es gibt Hinweise darauf, dass das Amastigotenwachstum in der Granulom-Mikroumgebung stark eingeschränkt ist [37]. Der Anstieg der Parasitenlast im Spätstadium lässt laut Untersuchungen anderer VL-Mausmodelle im Allgemeinen nach [38, 39]. Viele halbruhende Amastigoten befinden sich in einem deutlich strengen Stoffwechselzustand mit einem globalen Rückgang energieverbrauchender Prozesse [14, 37, 40]. Daher haben wir vermutet, dass die verringerte Stoffwechselstörung des Urins bei 12 WPI mit einem langsamen Wachstumszustand von Leishmania in einer Läsionsumgebung im mittleren bis späten Zeitraum zusammenhängen könnte.

In dieser Studie waren der Alanin-, Aspartat- und Glutamatstoffwechsel die signifikant betroffenen Stoffwechselwege bei 4 WPI. Es ist allgemein bekannt, dass Glutamat zusammen mit Alanin und Aspartat direkt an der Versorgung des Krebszyklus mit Zwischenprodukten beteiligt ist [41]. Es war auch am Differenzierungsprozess von Epimastigoten zu metazyklischen Trypomastigoten von Trypanosoma cruzi beteiligt [42]. Unter den an diesem Stoffwechselweg beteiligten Metaboliten waren L-Glutamin und D-Glucosamin-6-phosphat gemäß der Berechnung der Ionenstärke bei 4 WPI hochreguliert (Tabelle 2). Es wurde gezeigt, dass Leishmania-Amastigoten für die De-novo-Synthese von Glutamat und Glutamin stark vom mitochondrialen Stoffwechsel abhängig sind [14]. Darüber hinaus hat die Forschung gezeigt, dass Glutamin die Parasitenbeseitigung durch die Entwicklung einer wirksameren adaptiven Immunantwort gegen Leishmania verstärken kann, und es wurde auch eine Hochregulierung der mit der Glutaminolyse verbundenen Gene sowie ein Anstieg des Glutaminverbrauchs von Leishmania donovani nachgewiesen. infizierte Makrophagen [43]. Daher hängt die Hochregulierung des Glutamingehalts im Urin wahrscheinlich mit dem allgemeinen Nährstoffbedarf der Leishmania-Überlebens- und Immunzellen sowie der Verstärkung der Immunantwort des Wirts im früheren Infektionsstadium zusammen. D-Glucosamin-6-phosphat ist der Zwischenmetabolit von Glutamin zur Biosynthese von Hexosaminen. Es wurde berichtet, dass die Biosynthese von Hexosaminen, wie z. B. N-Acetylglucosamin, für das Wachstum und die Virulenz von Leishmania essentiell war [44], während in dieser Studie keine Hexosamine in Urinproben nachgewiesen wurden; Möglicherweise ist die Stoffwechselanalyse anderer Bioproben erforderlich. Bei einem WPI von 4 ist auch PPP ein betroffener Signalweg. PPP ist ein Schlüsselweg in Trypanosomatiden, der hauptsächlich Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH) als Quelle für Reduktionskraft und andere Produkte erzeugt, die verschiedene Teile des Stoffwechsels versorgen [45]. Die unterschiedlichen Metaboliten, die an diesem Stoffwechselweg beteiligt sind, einschließlich D-Gluconsäure, D-Glucono-1,5-lacton und D-Ribulose-5-phosphat (D-Ribulose-5-phosphat wurde aufgrund seines niedrigeren Konfidenzniveaus als Stufe 4 identifiziert und ist nicht dargestellt in Tabelle 2), und sie waren alle hochreguliert (Tabelle 2). Sie sind Zwischenmetaboliten des oxidativen Zweigs von PPP, und es wurde berichtet, dass PPP es Glucose ermöglicht, als Quelle für Ribose-5-phosphat in der Nukleotidbiosynthese zu dienen[46]. Daher versorgt der hochregulierte oxidative Zweig des PPP Parasiten wahrscheinlich mit Ribose-5-phosphat (R5P), das RNA und DNA produziert, sowie NADPH zur Verwendung als zelluläres Reduktionsmittel im Zellstoffwechsel. In jüngster Zeit hat sich PPP zu einem sehr attraktiven und praktikablen Stoffwechselweg in der Erforschung von Medikamentenzielen für Leishmaniose entwickelt, insbesondere für einige daran beteiligte Enzyme [47,48,49,50], was voraussichtlich zur Entwicklung neuer Medikamente gegen VL führen wird .

Dann stellten wir fest, dass der Tryptophanstoffwechsel bei 4 WPI und 12 WPI erkennbar beeinträchtigt war. Tryptophan ist eine essentielle Aminosäure bei Säugetieren und spielt eine wichtige Rolle bei der Immunmodulation des Wirts [51, 52]. Intrazelluläres L-Tryptophan wird über zwei Hauptwege abgebaut: (1) Umwandlung in Kynurenin über Indolamin-2,3-Dioxygenase oder Tryptophan-2,3-Dioxygenase [53] und (2) Umwandlung in einen Zwischenmetaboliten, 5-Hydroxytryptophan (5-HTP). ) über Tryptophanhydroxylase (TPH). In dieser Studie waren die bei 4 WPI oder 12 WPI nachgewiesenen Differenzialmetaboliten am 5-HTP-Weg beteiligt. Signifikante Unterschiede bei Metaboliten, die zum Kynurenin-Signalweg passen, wurden nicht festgestellt. Darüber hinaus wurden die differentiellen Metaboliten, die dem Tryptophan-Weg bei 4 WPI entsprachen, alle bei 12 WPI herunter- und hochreguliert. Im Allgemeinen spiegelte der Rückgang der Metaboliten eine verringerte Biosynthese oder einen verstärkten Katabolismus wider. Leishmania ist für Tryptophan auxotroph und es fehlen ihm die Gene für seine Biosynthese [54, 55]. Es wurde berichtet, dass Leishmania donovani während der Infektion in vitro eine große Menge Tryptophan verbraucht [12], und durch den Katabolismus im Tryptophanweg entsteht NAD+, das zur Aufrechterhaltung der Redoxhomöostase beitragen kann. Darüber hinaus unterdrückte der Tryptophanmangel in den Wirtszellen die T-Zell-Proliferation und förderte dadurch die Chronizität der Erkrankung [51, 56]. Ob die Herunterregulierung der Metaboliten im 5-HTP-Signalweg mit dem Tryptophanverbrauch bei einer Leishmania-Infektion zusammenhängt und dadurch die Immunität des Wirts im früheren Infektionsstadium schwächt, bedarf weiterer experimenteller Validierung, insbesondere Studien zur Rolle des 5-HTP-Signalwegs bei der VL-Progression.

Darüber hinaus stellten wir beim Tyrosinstoffwechsel fest, dass 3-Nitrotyrosin (3-Nitro-L-Tyrosin) sowohl bei 4 als auch bei 12 WPI signifikant schwankte. Aus Tabelle 3 geht hervor, dass es im Vergleich zu den Kontrollgruppen mehr als dreimal bei 4 WPI signifikant hochreguliert war, während es bei 12 WPI mehr als zweimal herunterreguliert war. 3-Nitrotyrosin, auch Nitrotyrosin genannt, ist ein Produkt der Tyrosinnitrierung, die durch reaktive Stickstoffspezies wie Peroxynitrit-Anion und Stickstoffdioxid vermittelt wird. 3-Nitrotyrosin ist ein gut etablierter stabiler Biomarker für oxidativen Stress und ein guter Prädiktor für das Fortschreiten einiger Krankheiten, wie z. B. kardiovaskulärer und neurodegenerativer Erkrankungen [57,58,59]. Die erhöhte Produktion von 3-Nitrotyrosin stand in engem Zusammenhang mit der erhöhten mikrobiziden Aktivität in mit Leishmania infizierten Makrophagen [60]. Eine frühere Studie ergab, dass die Bildung von 3-Nitrotyrosin ein relevanter Indikator für die antiparasitäre Aktivität ist [61]. Daher könnte die Hochregulierung von 3-Nitrotyrosin bei 4 WPI im Urin mit der erhöhten antiparasitären Aktivität infizierter Makrophagen in der früheren Infektionsperiode zusammenhängen, und die Herunterregulierung bei 12 WPI hing wahrscheinlich mit dem Fortschreiten der VL zum späten chronischen Infektionsstadium zusammen. Sicherlich müssen diese Schlussfolgerungen noch einer eingehenden Validierung unterzogen werden. Darüber hinaus war der Metabolit Taurin, der am Taurin- und Hypotaurinstoffwechsel beteiligt ist, bei 12 WPI hochreguliert. Taurin, eine der am häufigsten vorkommenden Aminosäuren, besitzt entzündungshemmende und immunregulatorische Eigenschaften [62] und schützt vor verschiedenen Arten von Leberschäden [63, 64]. Die Rolle von Taurin im VL-Prozess und ob seine Hochregulierung in dieser Studie mit der Selbstlimitierung pathologischer Läsionen in der Leber zusammenhängt, ist jedoch unbekannt.

Im Hinblick auf Verfügbarkeit und Compliance ist Urin die Probenart, die nichtinvasiv in großen Mengen entnommen werden kann. Die Fülle an terminalen Metaboliten des biochemischen Stoffwechsels des Körpers macht Urin auch zu einer wertvollen Probe bei der Suche nach Biomarkern [23, 27], und die Entdeckung von Biomarkern ermöglicht ein besseres Verständnis des zugrunde liegenden pathogenen Mechanismus. In dieser Studie wurden 12 Metaboliten identifiziert, die sowohl bei 4 als auch bei 12 WPI signifikant variierten. In der univariaten ROC-Analyse zeigten 7 der 12 Metaboliten eine relativ zufriedenstellende Leistung bei der Unterscheidung zwischen der Infektionsgruppe und der Kontrollgruppe mit einer AUC > 0,8 (Tabelle 3). Daher wurden die sieben Metaboliten als potenzielles Biomarker-Panel ausgewiesen, das für die Diagnose getestet werden soll. Die Ergebnisse des multivariablen ROC-Tests legten nahe, dass das ausgewählte Biomarker-Panel eine starke Fähigkeit hatte, die Infektionsgruppen von den Kontrollgruppen bei 4 und 12 WPI zu unterscheiden (Abb. 9A, B). Darüber hinaus wurde auch die Fähigkeit des Biomarker-Panels gezeigt, die Infektionsgruppen zwischen 4 und 12 WPI zu trennen (Abb. 9C). Diese Analysen zeigten, dass das Biomarker-Panel aus sieben Urinmetaboliten Potenzial für die VL-Diagnose und die Überwachung des Infektionsstadiums haben könnte, was eine weitere Validierung wert wäre.

Gemäß der Änderung der Ionenstärke (Tabelle 3; Abb. 9D) wurden die fünf von sieben Metaboliten bei 4 WPI herunterreguliert und bei 12 WPI drastisch hochreguliert, wobei das gleiche Änderungsmuster darauf hindeutete, dass diese Metaboliten möglicherweise an engen Stoffwechselwegen beteiligt sind. Allerdings fehlten den meisten dieser Metaboliten detaillierte Informationen in der vorhandenen Substanzbibliothek. Unter den beiden anderen Metaboliten war Dl-5-Methoxytryptophan (5-MPT) sowohl bei 4 WPI als auch bei 12 WPI hochreguliert. 5-MPT ist ein endogener Metabolit, der in Fibroblasten über einen neuartigen Tryptophan-Stoffwechselweg produziert wird [65] und nachweislich in der Lage ist, übermäßige systemische Entzündungsreaktionen und Sepsis abzuwehren [66]. Es könnte auch zur Verringerung des Tumorwachstums und der Metastasierung sowie zur Verringerung der Intimahyperplasie bei Gefäßerkrankungen beitragen [65, 67, 68]. Bisher liegen uns jedoch keine Untersuchungen zu 5-MPT bei Leishmaniose vor. Jüngsten Studien zufolge könnte 5-MPT nicht nur ein diagnostischer und therapeutischer Biomarker für Krankheiten sein, sondern auch eine wertvolle Leitverbindung sein, und seine Synthetase TPH-1 könnte als Zielmarker für einige Krankheiten dienen [68,69,70,71]. . Daher ist eine weitere gezielte Validierung von 5-MPT für sein diagnostisches Potenzial erforderlich. In der Zwischenzeit wäre die Erforschung der biologischen Funktion von 5-MPT und der Expression seiner Synthetase hilfreich, um die Rolle von 5-MPT bei der VL-Progression zu verstehen.

In dieser Studie ergab die Urin-Metabonomik-Analyse, dass der Stoffwechsel von Goldhamstern nach einer Leishmaniose-Infektion erheblich gestört war. Somit war der Aminosäurestoffwechsel zu beiden Infektionszeitpunkten stark beeinträchtigt. Es zeigte auch deutliche Stoffwechselmerkmale im frühen und späten Stadium der VL-Progression. Die Anzahl der gestörten Metaboliten und Stoffwechselwege war bei 4 WPI offensichtlich größer als bei 12 WPI. Neben dem Aminosäurestoffwechsel betraf der beeinflusste Stoffwechsel auch den Kohlenhydrat- und Nukleotidstoffwechsel bei 4 WPI. Dies kann mit den Unterschieden im Nährstoffbedarf der Parasiten und/oder den Immunantworten des Wirts in früheren und mittleren bis späten Stadien der VL zusammenhängen. Darüber hinaus unterschieden sich die Ergebnisse dieser Studie erheblich von denen unserer vorherigen Metabonomics-Studie im Serum, die darauf hindeutete, dass der Lipidstoffwechsel der am stärksten beeinflusste Weg nach der Infektion war. Zusammengenommen tragen Metabonomics-Studien aus verschiedenen biologischen Proben zum Gesamtverständnis der Stoffwechseleigenschaften von VL bei. Die sieben Metaboliten wurden in dieser Studie als potenzielles Biomarker-Panel untersucht, das ein gutes Potenzial für die VL-Diagnose hat und einer weiteren Validierung würdig ist, was voraussichtlich zur Entwicklung eines neuartigen diagnostischen Ansatzes und zur Verlaufsüberwachung von VL beitragen wird. Unsere Studie bietet darüber hinaus umfangreichere Stoffwechselinformationen zu Leishmania-infizierten Wirten, von denen wir hoffen, dass sie eine neue Richtung für zukünftige Forschungen zu den molekularen Mechanismen der Leishmania-Infektion bieten.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. Die Rohdaten wurden auf Metabolights hochgeladen, die Zugangsnummer ist MTBLS8191. Bitte finden Sie es unter https://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS8191.

Woche nach der Infektion

Viszerale Leishmaniose

Partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate

Betriebscharakteristik des Empfängers

Hauptkomponentenanalyse

Faltwechsel

Variable Bedeutung für die Projektion

Positiver und negativer Modus bei der Elektrospray-Ionisation

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Referenzen herunterladen

Wir danken dem West China Hospital der Sichuan-Universität für die Bereitstellung des in dieser Studie verwendeten Leishmania-Isolats und dem Beijing Genomics Institute für die Durchführung des Metabolomics-Nachweises.

Dieses Projekt wurde von der National Natural Science Foundation of China (Zuschuss-Nr. 81802034) und den Fundamental Research Funds for the Central Universities (Zuschuss-Nr. 2019SCU12014) unterstützt.

Abteilung für menschliche Anatomie, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu, 610041, Sichuan, Volksrepublik China

Dongmei Yuan & Zhiwei Zhao

Abteilung für Pathogene Biologie, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu, 610041, Sichuan, Volksrepublik China

Jianping Chen

Zentrum für klinische Studien, Chengdu Second People's Hospital, Chengdu, 610021, Sichuan, Volksrepublik China

Hanxiao Qin

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YDM hat die Forschung entworfen. QHX hat die Experimente entworfen. YDM und QHX führten die Experimente durch. YDM und QHX analysierten die Daten. CJP überwachte die Studie. ZZW stellte die Versuchsapparatur zur Verfügung. YDM hat den Artikel geschrieben.

Korrespondenz mit Zhiwei Zhao oder Hanxiao Qin.

Die Verfahren dieses Artikels wurden von der medizinischen Ethikkommission der Abteilung für medizinisches Management der Universität Sichuan geprüft und genehmigt, und nach deren Richtlinien für das Wohlergehen von Versuchstieren wurden die Experimente durchgeführt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Echtzeit-PCR-Bedingung für Leishmania-Belastung.

Detaillierte Methode zur Vorbehandlung von Urinproben und die Komponente der inneren Standards.

Echtzeit-PCR-Standardkurve.

TIC-Kurven und PCA-Diagramme von QC-Proben. (A) Die TIC-Kurven der QC-Proben waren stark überlappend. Die linke Seite repräsentiert den ESI+-Modus und die rechte stellt den ESI−-Modus dar. (B) PCA-Diagramme von QC-Proben. Schwarze Pfeile zeigen auf die Punkte der QC-Proben, die stark aggregiert waren.

PLS-DA-Diagramme experimenteller Proben im ESI-Modus. (A) Kontrolle vs. Infektion bei 4 WPI. R2 = 1,00, Q2 = 0,78. (B) Kontrolle vs. Infektion bei 12 WPI. R2 = 0,99, Q2 = 0,62. (C) 4 WPI vs. 12 WPI der Infektionsgruppe. R2 = 0,99, Q2 = 0,68.

Detaillierte Informationen zu den gesamten Differenzialmetaboliten in dieser Studie.

Heatmaps von Differenzmetaboliten bei 4 WPI und 12 WPI im ESI-Modus. (A) Ergebnisse bei 4 WPI im ESI-Modus. (B) Ergebnisse bei 12 WPI im ESI-Modus.

Detaillierte Informationen zum übereinstimmenden Status jedes fehlregulierten Signalwegs.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Der Creative Commons Public Domain Dedication-Verzicht (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) gilt für die in diesem Artikel zur Verfügung gestellten Daten, sofern in einer Quellenangabe für die Daten nichts anderes angegeben ist.

Nachdrucke und Genehmigungen

Yuan, D., Chen, J., Zhao, Z. et al. Metabolomische Analyse der viszeralen Leishmaniose anhand des Urins von Goldhamstern. Parasites Vectors 16, 304 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05881-3

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Eingegangen: 05. April 2023

Angenommen: 12. Juli 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05881-3

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