Identifizierung von Glutathion-Stoffwechselgenen aus einem dimorphen Pilz Talaromyces marneffei und ihrer Genexpressionsmuster unter verschiedenen Umweltbedingungen

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13888 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Talaromyces marneffei ist ein menschlicher Pilzpathogen, der vor allem in Südostasien endemische opportunistische Infektionen verursacht. Die wichtigsten Virulenzfaktoren von T. marneffei sind die Fähigkeit, vom Wirt ausgehende Hitze und oxidativen Stress zu überleben, sowie die Fähigkeit, während der Infektion die Morphologie von Umweltschimmel in Spalthefeformen umzuwandeln. Der Glutathionstoffwechsel spielt eine wesentliche Rolle bei der Stressreaktion und der Zellentwicklung in mehreren Organismen. Die Rolle des Glutathionsystems in T. marneffei ist jedoch unklar. Hier haben wir die Gene identifiziert, die für die Hauptenzyme kodieren, die mit dem Glutathionstoffwechsel in T. marneffei verbunden sind, darunter Glutathion-Biosyntheseenzyme (Gcs1 und Gcs2), Glutathionperoxidase (Gpx1), Glutathionreduktase (Glr1) und eine Familie von Glutathion-S-Transferasen (Gst ). Die Suche nach Sequenzhomologien ergab eine erweiterte Familie der TmGst-Proteine, bestehend aus 20 TmGsts, die in mehrere Klassen unterteilt werden konnten. Die Expressionsanalyse ergab, dass Zellen in der Konidien-, Schimmel- und Hefephase unterschiedliche Expressionsprofile von Glutathion-verwandten Genen aufwiesen. Außerdem wurden die TmGst-Gene als Reaktion auf die Exposition gegenüber Wasserstoffperoxid und Xenobiotika stark hochreguliert. Insgesamt legen unsere Ergebnisse nahe, dass T. marneffei die Glutathion-Gene unter Stressbedingungen zelltypspezifisch transkriptionell reguliert. Diese Studie könnte zum Verständnis der Rolle von Glutathion beim thermisch induzierten Dimorphismus und der Stressreaktion beitragen.

Talaromykose wird durch Talaromyces marneffei verursacht, einen aufkommenden opportunistischen Pilzpathogen, der in Ländern der tropischen und subtropischen Zonen Asiens endemisch ist, beispielsweise in China, Taiwan, Hongkong, Thailand, Laos, Vietnam und im Nordosten Indiens1,2,3. Die Ökosysteme in diesen Gebieten sind in der Regel mit hoher Luftfeuchtigkeit verbunden, was die Ausbreitung des Pilzreservoirs in der Umwelt fördern könnte4. In Endemiegebieten gibt es jährlich etwa über 173.000 Fälle von Talaromykose mit 4.900 damit verbundenen Todesfällen4. Talaromyces marneffei infiziert hauptsächlich immungeschwächte Personen, und Infektionen sind eng mit Menschen verflochten, die in armen, ländlichen Gebieten leben, wo sie Feldfrüchten, Nutztieren und Böden ausgesetzt sind. Tatsächlich war das Risiko, an Talaromykose zu erkranken, bei Landwirten um 70–90 % höher als bei Nichtlandwirten5. Insgesamt ist Talaromykose mit einer hohen Mortalität und Morbidität verbunden, und prädisponierende Faktoren stehen in engem Zusammenhang mit einem geschwächten Immunsystem.

T. marneffei ist ein thermisch dimorpher Pilz, der bei Umgebungstemperaturen (25 °C) als filamentöse Hyphen wächst und bei menschlicher Körpertemperatur (37 °C) eine morphologische Umwandlung in die Hefeform durchläuft6. Konidien, die infektiösen asexuellen Sporen aus der Umwelt, können in die Lunge eines Patienten eingeatmet werden und anschließend von Alveolarmakrophagen verschlungen werden, wo die Konidien zu den pathogenen Hefezellen wechseln und eine Infektion verursachen7,8. In Makrophagen wächst T. marneffei als Spalthefe, in der extrazellulären Umgebung erscheint es jedoch als Arthroconidia-ähnliche Hefezelle. Die Mechanismen, die den Dimorphismus steuern, sind noch wenig verstanden. Eine Reihe von Faktoren, die an der Morphogenese und dem Phasenübergang beteiligt sind, wurden teilweise identifiziert9,10. Diese Faktoren hängen beispielsweise mit der Transkriptionsregulation, der G-Protein-Signalisierung und Kinasen zusammen11. Daher sind dringend weitere Studien erforderlich, um wichtige Regulatoren zu identifizieren, die den dimorphen Schaltprozess steuern.

Einer der wichtigsten pathogenen Faktoren ist das Antioxidanssystem. Während der Infektion erzeugen die Immunzellen des Wirts die reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reaktiven Stickstoffspezies (RNS), um eindringende Krankheitserreger abzutöten12,13,14,15. Als Reaktion auf den vom Wirt ausgehenden oxidativen Stress aktiviert T. marneffei den MAPK-Signalweg und mehrere Transkriptionsfaktoren, um antioxidative Proteine zu erzeugen, die letztendlich zur Neutralisierung des vom Wirt erzeugten ROS/RNS16 verwendet werden. Zu diesen antioxidativen Molekülen gehören Superoxiddismutase (sodA), Katalase-Peroxidase (cpeA) und Glutathionperoxidase (gpx1), die in der pathogenen Hefeform hochreguliert sind17,18,19. Es wurde gezeigt, dass sodA und cpeA bereits 2 Stunden nach der Phagozytierung erhöht waren17,18. Darüber hinaus zeigte die cpeA-Deletionsmutante eine verringerte Toleranz gegenüber Wasserstoffperoxid, was auf seine antioxidative Rolle bei diesem Pilz schließen lässt18. Diese bahnbrechenden Studien zeigten, dass die Antioxidationssysteme erheblich zur Überlebensfähigkeit dieses Pilzes im Wirtsmakrophagen und damit zum Erfolg von T. marneffei bei der Pathogenese beitragen.

Glutathion (GSH, L-γ-Glutamylcysteinylglycin) ist ein wichtiger Metabolit in Eukaryoten und spielt eine wichtige Rolle beim Schutz der Zellen vor oxidativen Schäden20. Glutathion fängt verschiedene Oxidationsmittel wie Superoxidanionen, Hydroxylradikale, Kohlenstoffradikale und Stickoxid direkt ab20. Bei mikrobiellen Krankheitserregern kann Glutathion als Signalmolekül zur Modulation von Virulenzwegen fungieren21,22,23. In der Hefepopulation wird Glutathion ausgeschieden und extrazellulär angesammelt, um schädliche Chemikalien zu bekämpfen, die durch unerträglich hohe Temperaturen entstehen24. Darüber hinaus ist Glutathion ein Cofaktor für verschiedene antioxidative Enzyme wie Glutathionperoxidase und Glutathion-S-Transferase25,26. Es gibt zwei Zustände von Glutathion in den Zellen: reduziertes Glutathion (GSH) und oxidiertes Glutathiondisulfid (GSSG). Unter stressfreien Bedingungen ist GSH ein wichtiges Antioxidans, während GSSG angesammelt wird, wenn Zellen einem erhöhten Maß an oxidativem Stress ausgesetzt sind. Im Allgemeinen weisen erhöhte Verhältnisse von GSSG zu GSH auf oxidativen Stress hin. Somit halten die Zellen den Spiegel an reduziertem Glutathion durch das Gleichgewicht seiner Synthese und Reduktion eng aufrecht. Das Glutathion-Homöostasesystem enthält hauptsächlich fünf Enzyme: γ-Glutamylcystein-Synthetase und Glutathion-Synthetase, die an der Glutathion-Biosynthese beteiligt sind, Glutathion-Peroxidase und Glutathion-Reduktase, die am Recycling von GSH beteiligt sind, und Glutathion-S-Transferase, die an der Entgiftung mehrerer Stressoren beteiligt ist20,25,27. Insbesondere stellen die Glutathion-S-Transferase-Proteine eine erweiterte Familie multifunktionaler Enzyme dar, die an verschiedenen Signalwegen wie der Reaktion auf oxidativen Stress und der Entgiftung verschiedener Substrate beteiligt sind28. Gsts entgiften beispielsweise xenobiotische Substrate, indem sie GSH mit bestimmten xenobiotischen Verbindungen konjugieren und so die Ausscheidung der Xenobiotika aus den Zellen verbessern. Trotz der zentralen Rolle in den Zellen wurde die Funktion des Glutathionsystems für das Überleben und den Dimorphismus der Zellen bei T. marneffei nicht vollständig charakterisiert.

Hier haben wir über das gesamte Glutathionsystem in T. marneffei berichtet. Darüber hinaus wurde die Beteiligung des Glutathionsystems in verschiedenen Zelltypen von T. marneffei und unter oxidativen Stressbedingungen untersucht. Wir haben die Gene charakterisiert, die für Glutathion-Biosyntheseenzyme, Glutathionreduktase (glr), Glutathionperoxidase (gpx) und Glutathion-S-Transferasen (gsts) kodieren. Die 20 gst-Gene von T. marneffei wurden durch eine genomweite Annotationssuche entdeckt und anschließend durch eine phylogenetische Baumanalyse klassifiziert. Wir untersuchten die Expressionsmuster und die Transkripthäufigkeit dieser Gene in Bezug auf Konidien-, Schimmel- und Hefephasen. Durch die Analyse des Genexpressionsprofils von zwei verschiedenen T. marneffei-Stämmen fanden wir heraus, dass mehrere Glutathion-verwandte Gene phasenspezifische Expressionsmuster aufweisen. Die für TmGst kodierenden Gene wurden bei Exposition gegenüber oxidativen und xenobiotischen Stressfaktoren stark induziert. Diese Studie liefert die ersten Einblicke auf Transkriptebene in die Glutathion-Genfamilie von T. marneffei, die zum morphologischen Wechsel und zur Anpassung an oxidativen Stress während einer Wirtsinfektion beitragen könnten.

Wir durchsuchten das annotierte Genom von T. marneffei und sammelten mutmaßliche Gene, die für Glutathion-Stoffwechselenzyme kodieren (Tabellen 1 und 2). Alle Glutathion-bezogenen Gene sind in diesem Pilz konserviert. Für Glutathionperoxidase besitzt T. marneffei nur ein Homolog, das eng mit dem Glutathionperoxidase-Protein Hyr1 (Gpx3) aus Saccharomyces cerevisiae verwandt ist. Das Gen wurde gpx129 genannt. Die Aminosäuresequenzen der Glutathionperoxidase aus T. marneffei wurden bei Homologiesuchen gegen andere häufige menschliche Pilzpathogene verwendet (Abb. 1). Die Ausrichtung der Aminosäuresequenzen zeigt, dass TmGpx1 eine hohe Identität mit der Glutathionperoxidase Hyr1 aus Aspergillus fumigatus (77 %), der Glutathionperoxidase Hyr1 aus Histoplasma capsulatum (73 %), der Glutathionperoxidase Hyr1 aus Coccidioides immitis (73 %) und der Glutathionperoxidase Hyr1 aus Paracoccidioides brasiliensis Pb18 (67) aufweist %). Im Gegensatz zur hohen Konservierung unter pathogenen Pilzen weist TmGpx1 nur eine 40-prozentige Identität mit den menschlichen Gpx7- und Gpx8-Proteinen auf. Die Reste Selen-Cystein (U) oder Cystein (C) im aktiven Zentrum bilden zusammen mit Glutamin (Q) und Tryptophan (W) die charakteristische „katalytische Triade“ der Glutathionperoxidase-Familie30. Die Reste, aus denen diese katalytische Triade CQW besteht, sind in allen verglichenen Sequenzen konserviert. Auch die Signaturmuster rund um die Triade sind weitgehend erhalten. Die erste konservierte Region enthält eine Konsensussequenz für das aktive Zentrum (GKVVLVVNTASKCGFT). Die zweite konservierte Region ist LGFPCNQF mit der Bezeichnung Glutathionperoxidase-Signatur 2. Die dritte Region wurde nur in TmGpx1 gefunden und wird als Lipocalin-Sequenzsignatur (NGKGEVVGRWRSI) bezeichnet, was darauf hindeutet, dass diese Sequenzen möglicherweise spezifische Funktionen in T. marneffei haben. Insgesamt enthält das TmGpx1-Protein sowohl hochkonservierte Regionen als auch T. marneffei-spezifische Signatursequenzen.

TmGpx1 (TmHyr1) weist eine hohe Homologie mit anderen Glutathionperoxidasen aus Pilzen auf und enthielt die konservierte katalytische Triade CQW. Proteinsequenzen wurden aus der BLAST-Analyse erhalten. Das Proteinsequenz-Alignment wurde mit Clustal Omega durchgeführt. Funktionale Domänen wurden mit dem webbasierten Analysetool ScanProsite ermittelt. Gelbe Markierung = Aktive Site (PS00460); Grüne Markierung = Signatur 2 (PS00763); Blaue Markierung = Lipocalin-Signatur (PS00213); Magenta-Hervorhebung = Rückstände, die die katalytische Triade CQW bilden. Die Symbole unter der Ausrichtung geben die Konservierung an: Sternchen (*) bezeichnet eine einzelne vollständig konservierte Aminosäure, Doppelpunkt (:) bezeichnet Aminosäuregruppen mit stark ähnlichen Eigenschaften und Punkt (·) bezeichnet Gruppen mit schwach ähnlichen Eigenschaften. Pilzarten werden wie folgt abgekürzt: Af: Aspergillus fumigatus, Cn: Cryptococcus neoformans, Ss: Sporothrix schenckii, Pb: Paracoccidioides brasiliensis, Tm: Talaromyces marneffei, Hc: Histoplasma capsulatum, Ci: Coccidioides immitis, Sc: Saccharomyces cerevisiae, Ca: Candida albicans.

Um die evolutionäre Beziehung zwischen Pilz-Gpx-Proteinen zu verstehen, haben wir mithilfe von MEGA 11-Programmen einen phylogenetischen Baum erstellt. Basierend auf der phylogenetischen Baumanalyse ist TmGpx1 am engsten mit Hyr1 aus A. fumigatus verwandt (Abb. 2). Darüber hinaus ist TmGpx1 enger mit dem Fadenpilz Aspergillus und anderen thermisch dimorphen Pilzen verwandt als Hefen wie S. cerevisiae, Candida albicans und Cryptococcus neoformans.

Phylogenetische Baumanalyse der Glutathionperoxidase in häufigen pathogenen Pilzen. Aminosäuresequenzen dieser Proteine wurden wie in Abb. 1 beschrieben erhalten. Der benachbarte phylogenetische Baum der Gpx1-Familie wurde mit der MEGA-Software mit einem Bootstrap-Wert von 1000 erstellt. Grüne Kreise an Knoten des phylogenetischen Baums stellen nur Bootstrap-Werte dar Es werden Werte über 40 angezeigt. Drei Klassen von Glutathionproteinen sind in unterschiedlichen Farben schattiert. Das Sternchen zeigt Glutathionperoxidase aus T. marneffei an. Die Zugangsnummern aller Proteine sind in den Zusatzdaten S1 aufgeführt. Pilzarten werden wie folgt abgekürzt: Af: Aspergillus fumigatus, Cn: Cryptococcus neoformans, Ss: Sporothrix schenckii, Pb: Paracoccidioides brasiliensis, Tm: Talaromyces marneffei, Hc: Histoplasma capsulatum, Ci: Coccidioides immitis, Sc: Saccharomyces cerevisiae, Ca: Candida albicans.

Gsts umfassen eine komplexe und weit verbreitete Enzymfamilie, und deshalb haben wir die KEGG-Signalwegkarte und das BLAST-Programm verwendet, um nach Gst-kodierenden Genen zu suchen. Es wurde vorhergesagt, dass insgesamt 20 nicht-redundante Genorte für mutmaßliche Gst-Proteine voller Länge in T. marneffei kodieren, die als TmGst1–TmGst20 bezeichnet wurden. Die Sequenzmerkmale sind in Tabelle 2 aufgeführt und die Domänenarchitekturen sind in Abb. 3a dargestellt. Die Sequenzlängen der TmGsts reichten von 164 (TmGst4) bis 406 (TmGst13) Aminosäuren. Die meisten TmGsts wurden vom WolF-PSORT vorhergesagt, dass sie sich im Zytoplasma (9 von 20 Proteinen) lokalisieren, gefolgt von Mitochondrien und dem Zellkern (Abb. 3b, Tabelle 2, vollständige Einzelheiten siehe Tabelle S2). Unsere Domänenanalyse mit Uniprot-, SMART- und CDD-Tools (Conserved Domain Database) ergab das Vorhandensein von zwei konservierten Domänen, der N-terminalen Domäne (GSH-Bindungsstelle) und der C-terminalen Domäne (Substratbindungsstelle) (Abb. 3a). Dem TmGst4, dem TmGst18 und dem TmGst20 fehlte die Gst-C-terminale Domäne, und dem TmGst5 fehlte die Gst-N-terminale Domäne. Außerdem wurden in vielen TmGst-Proteinen mehrere andere spezifische Domänen entdeckt. Das TmGst12 war das mitochondriale Metaxin-ähnliche Protein und enthielt daher eindeutig die Domänen SAM35 (PF10806), GST N-terminal (PF17172) und Metaxin GST C-terminal (PF17171). Diese spezifische N-terminale GST-Domäne (PF17172) wurde auch in TmGst20 vorgestellt. Wir haben in TmGst13 eine ausgeprägte Efb1-Gamma-Domäne (PS50040, PF00647) gefunden. Außerdem war die MAPEG-Domäne (PF01124) nur im TmGst16 vorhanden, was darauf hinweist, dass es sich bei TmGst16 um ein mutmaßliches membrangebundenes mikrosomales Gst-Protein handelte. Dies stimmte mit der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung von TmGst16 im extrazellulären Raum überein. Die DSBA-ähnliche Thioredoxindomäne (PF01323), die häufig in der Gst-Kappa-Familie vorkommt, wurde in TmGst17 einzigartig präsentiert. Die Gst-Kappa-Proteinfamilie kommt normalerweise in Mitochondrien und Peroxisomen vor, was mit der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung von TmGst17 in Peroxisomen übereinstimmt (Abb. 3b und Tabelle 2).

Eigenschaften von 20 Gsts von T. marneffei. (a) Die Domänenarchitektur von Gst-Proteinen aus T. marneffei wurde dargestellt. Die Aminosäuresequenzen und mutmaßlichen Proteindomänen wurden von Uniprot abgerufen. Proteindomänenarchitekturen wurden mit dem webbasierten IBS-Tool generiert. (b) Die mutmaßliche subzelluläre Lokalisierung von 20 TmGsts ist dargestellt. Das WoLF PSORT-Programm wurde verwendet, um die subzelluläre Lokalisierung von TmGst vorherzusagen. mito = Mitochondrien, zyto = Zytoplasma, nucl = Kern, zysk = Zytoskelett, extr = extrazellulärer Raum, pero = Peroxisom.

Gst-Proteine können anhand einer Vielzahl von Kriterien klassifiziert werden, darunter subzelluläre Lokalisierung, Aminosäuresequenzen, immunologische, kinetische und strukturelle Eigenschaften. Den Aminosäuresequenzidentitäten zufolge wurden bislang mindestens neun Klassen zytosolischer Gsts in Pilzen beschrieben, darunter GTT1, GTT2, Ure2, MAK16, EFB1, GSTFuA, Glutathionylhydrochinonreduktase (GHR), Phi und Omega28,31,32 ,33. Um die Klassifizierung und Untersuchung der evolutionären Beziehung zwischen Mitgliedern der TmGst-Familie zu ermöglichen, wurden insgesamt 48 Gst-Aminosäuresequenzen voller Länge aus Pilzen, Nematoden und Menschen ausgerichtet, um einen phylogenetischen Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit zu erstellen. Hier können basierend auf dem konstruierten phylogenetischen Baum mehrere Cluster unterschieden werden (Abb. 4). Der Baum zeigt deutlich, dass die größte Klasse von TmGsts die Ure2-ähnliche Klasse ist (5 Mitglieder). Die Ure2-ähnliche Klasse besteht aus TmGst1, TmGst2, TmGst3, TmGst10 und TmGst15. TmGst4, TmGst14, TmGst18 und TmGst19 bilden einen Cluster mit anderen Gst-Zeta-Proteinen, und daher stellt die Zeta-Klasse die zweitgrößte Gruppe von TmGsts dar (4 Mitglieder). Die GTT1-Klasse enthält TmGst5, TmGst6 und TmGst7. TmGst8 und TmGst9 sind Teil der Gst-Theta-Klasse. Das TmGst13 zeigt einen Cluster mit anderen pilzlichen EF1B-Proteinen, konsistent mit seinen Proteindomänenstrukturen. Insgesamt sind Ure2 und Zeta die größten Klassen von TmGsts, und die Klassifizierung der TmGst-Proteine stimmt größtenteils mit ihrer Proteindomänenarchitektur überein.

Phylogenetische Beziehungen zwischen den 20 TmGsts. Proteinsequenzen wurden durch BLAST-Analyse erhalten, darunter 48 Proteine aus Pilzen, Menschen und Nematoden. Die Aminosäuresequenzen wurden mit Clustal Omega abgeglichen und mit der MEGA 11-Software mit 500 Bootstraps ein Maximum-Likelihood-Baum erstellt. Die roten Buchstaben stellen die Gsts von T. marneffei dar. Magentafarbene Kreise an Knoten des phylogenetischen Baums zeigen Bootstrap-Werte an, und es werden nur Werte über 40 angezeigt. Die Zugangsnummern aller Proteine sind in den Zusatzdaten S2 aufgeführt.

T. marneffei kann zwischen Schimmel- und Hefeformen wechseln, und dieser Umwandlungsprozess wird thermisch reguliert6. Mittlerweile gilt der Temperaturanstieg als einer der Umweltstressoren24. Ein Hitzeschock kann zu oxidativem Stress führen, da Hitze eine verstärkte Atmung auslösen kann, was zu erhöhten intrazellulären Oxidationsniveaus führt34,35. Es wurde gezeigt, dass Komponenten des Glutathion-abhängigen antioxidativen Systems an der Hitzeschockreaktion beteiligt sind, darunter GSH34,35, Gcs1 und Gcs234,35, Glr36,37 und Gst38. Ein weiterer wichtiger Zelltyp ist das Konidium, das aus der Schimmelphase entsteht und als Entwicklungsstadium betrachtet wird. Dementsprechend wollten wir die Beteiligung des Glutathionsystems von T. marneffei als Reaktion auf temperaturbedingte morphologische Veränderungen und Konidiation untersuchen, indem wir die Transkriptmengen von Glutathiongenen bewerteten. Um die Expressionsprofile von Zielgenen zu untersuchen, wurden Konidien des T. marneffei-Stamms ATCC200051 (klinisch isolierter Stamm, menschliche Infektion, 1996) und ATCC18224 (isolierter Bambusrattenstamm) entweder direkt geerntet oder in Sabourauds Dextrose-Bouillon (SDB) inokuliert und gezüchtet für 72 Stunden bei 25 °C oder 37 °C, um die Schimmel- bzw. Hefephase einzuleiten. Aus diesen Proben wurde RNA gesammelt und eine quantitative Echtzeit-PCR durchgeführt, um die Genexpressionsniveaus zu messen.

Durch den Vergleich der Genexpressionsmuster von zwei unterschiedlichen Stammhintergründen konnten wir identifizieren, welche Glutathion-Gene in drei Zelltypen transkriptionell reguliert wurden: Konidien, Schimmel und Hefe. Die Genexpressionsanalyse zeigte, dass das gpx1-Gen in Konidien- und Hefezellen stark exprimiert wurde. Im Stamm ATCC200051 waren die Expressionsniveaus des gpx1-Gens in Konidien- und Hefezellen im Vergleich zur Schimmelphase signifikant um das 2,4- bzw. 2,5-fache erhöht (Abb. 5a). Konsistent waren die Expressionsniveaus des gpx1-Gens im Stamm ATCC18224 in Konidien- und Hefezellen um das 21-fache bzw. das Vierfache signifikant erhöht (Abb. 5b). Das gcs2-Gen war in Konidien aus zwei Stammhintergründen signifikant hochreguliert, nämlich um das 2,5-fache im Stamm ATCC200051 (Abb. 5a) und um das 3,5-fache im Stamm ATCC18224 (Abb. 5b). Unser Ergebnis legt nahe, dass beide T. marneffei-Stämme die gpx1- und gcs2-Gene in Konidien- und Hefezelltypen transkriptionell regulieren.

Glutathion-metabolisches Genexpressionsprofil in T. marneffei, das in verschiedenen Zellzuständen wächst. Eine quantitative Echtzeit-PCR wurde mit RNA durchgeführt, die aus T. marneffei extrahiert wurde, der in Konidien-, Hefe- und Schimmelpilzphasen wächst. Konidien der Stämme T. marneffei ATCC200051 und ATCC18224 wurden entweder direkt geerntet oder in Sabouraud-Dextrose-Brühe inokuliert und 3 Tage lang bei 25 °C bzw. 37 °C gezüchtet, um die Schimmel- bzw. Hefephase zu induzieren (Einzelheiten siehe Materialien und Methoden). . Die relative Genexpression wurde mit der 2-∆Ct-Methode unter Verwendung von Actin als Referenzgen berechnet. Der relative Fold-Change wurde mit der Phase verglichen, in der das Transkript am niedrigsten war. Die Experimente wurden in drei biologischen Replikaten durchgeführt. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Statistisch signifikante Werte (*P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001) sind angegeben.

Obwohl sich die Genexpressionsniveaus von gcs1 und glr im Stamm ATCC18224 nicht signifikant unterschieden, konnten wir im Hintergrund des Stammes ATCC200051 unterschiedliche Expressionsniveaus dieser Gene feststellen. Wie in Abb. 5a gezeigt, wurde das gcs1-Gen signifikant in höheren Konzentrationen exprimiert und zeigte im Vergleich zu den Expressionsniveaus in der Hefephase einen 2,7-fachen Anstieg der Konidien und einen 3,6-fachen Anstieg des Schimmelpilzes. Das glr-Gen war in der Konidien- und Hefephase deutlich hochreguliert und zeigte im Vergleich zu den Expressionsniveaus in der Schimmelpilzphase einen zweifachen Anstieg bei den Konidien und einen 1,7-fachen Anstieg in der Hefephase. Unsere Ergebnisse unterstrichen den Unterschied in der Transkriptionsregulation von Glutathion-Genen zwischen verschiedenen Stammhintergründen. Bei der Kombination von Daten aus zwei Stammhintergründen stellten wir fest, dass die meisten Glutathion-bezogenen Transkripte in Konidien stark akkumuliert waren.

Um einen Einblick in das Gst-Genexpressionsprofil in Schimmel- und Hefeformen zu erhalten, haben wir zunächst Genexpressionsdaten von DNA-Mikroarrays abgerufen, die zuvor in Myzel- und Hefephasen von T. marneffei-Zellen durchgeführt wurden9. In der Studie von Lin et al. wurde der T. marneffei-Stamm B-6323, der aus einem Patienten mit Talaromykose-Hautläsionen isoliert wurde, in SDB inokuliert und 48 Stunden lang bei 25 °C oder 37 °C gezüchtet, um Schimmel und Hefe zu induzieren Phasen bzw. Um die Datenvisualisierung in unserer Analyse zu erleichtern, haben wir Genexpressionsdaten von Lin et al.9 in eine hierarchische Heatmap umgewandelt und dabei Log2-Werte normalisierter Genexpressionsniveaus verwendet. Sechzehn von zwanzig TmGsts zeigten eine unterschiedliche Genexpression zwischen Schimmel- und Hefephase (Abb. S1, Tabelle S3). Die Gene TmGst5, TmGst9, TmGst13 und TmGst17 wurden nicht auf unterschiedlichen Ebenen exprimiert (Daten nicht gezeigt). Vier TmGsts, TmGst6, TmGst11, TmGst12 und TmGst18, erhöhten ihre Expressionsniveaus in der Hefephase und wurden in der Heatmap zusammengefasst (Abb. S1, hervorgehoben im blauen Kasten). Der Rest der TmGst-kodierenden Gene (zwölf TmGsts) wurde in der Hefephase herunterreguliert (Abb. S1). Unter den herunterregulierten Genen in der Hefephase waren TmGst14 und TmGst3 die beiden Gsts mit der größten Abnahme ihrer Expressionsniveaus und zeigten eine 243-fache bzw. 71-fache Herunterregulierung (Abb. S1, hervorgehoben im rosa Kasten). .

Um weiter zu bestimmen, welche Gst-Mitglieder eine phasenspezifische Expression aufwiesen, untersuchten wir experimentell die Transkripte der ersten 10 Gsts, d Stämme. Die hierarchische Heatmap wurde erstellt (Abb. 6). Wie in Abb. 6 dargestellt, zeigten Konidien ein einzigartiges Genexpressionsprofil und bildeten einen von der Schimmel- und Hefephase getrennten Cluster. TmGst2 und TmGst10 zeigten hohe Expressionsniveaus in Konidien. Das TmGst10-Gen zeigte Konidienspezifität, indem es eine 220-fache Hochregulierung im Stamm ATCC200051 bzw. eine 300-fache Hochregulierung im Stamm ATCC18224 zeigte (Abb. 6 und S2). Das TmGst2-Gen wies das am wenigsten häufig vorkommende Transkript auf, zeigte jedoch eine über zehnfach erhöhte Akkumulation in Konidien beider Stammhintergründe (Abb. 6 und S3). Die TmGst6-Genexpression wurde in der Hefephase hochreguliert und zeigte einen 12-fachen bzw. neunfachen Anstieg bei den Stämmen ATCC200051 und ATCC18224 im Vergleich zu den in Konidien nachgewiesenen Genexpressionsniveaus (Abb. 6 und S4). Das TmGst3-Gen wurde in der Schimmelphase in höheren Konzentrationen exprimiert und zeigte einen vierfachen bzw. dreifachen Anstieg in den Stämmen ATCC200051 und ATCC18224 (Abb. 6 und S5). Unter Berücksichtigung zuvor durchgeführter Genexpressionsdaten (Lin et al.9) und unserer aktuellen Daten zeigten die TmGst6- und TmGst3-Gene durchweg ähnliche Genexpressionsprofile über drei verschiedene getestete Stammhintergründe hinweg. Insbesondere wurde TmGst6 in der Hefephase und TmGst3 in der Schimmelphase hochreguliert. Unsere Studie legte auch nahe, dass das TmGst10-Transkript in Konidien stark akkumuliert war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass jedes Gst in verschiedenen Zelltypen von T. marneffei unterschiedliche Rollen spielt.

Heatmap zeigt die Expressionsmuster von Gst-Genen aus zwei verschiedenen Stammhintergründen. Das Genexpressionsprofil wurde von den Stämmen T. marneffei ATCC18224 (a) und ATCC200051 (b) erhalten. Die Namen der Gst-kodierenden Gene sind auf der rechten Seite angegeben und die Wachstumsbedingungen (Konidien, Schimmel und Hefe) sind unten angegeben. Dendogramme befinden sich links und oben auf der Heatmap. Die Heatmap wurde unter Verwendung des Log2 der relativen Genexpressionswerte (2−∆Ct) erstellt. Stämme wurden gezüchtet, RNA hergestellt und die Genexpression analysiert, wie in der Legende von Abb. 5 beschrieben. Die Experimente wurden in drei biologischen Replikaten durchgeführt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die meisten Glutathion-Stoffwechselgene transkriptionell reguliert wurden, als T. marneffei thermisch induzierte morphologische Veränderungen oder Konidiation erfuhr (Tabelle 3). Unsere Ergebnisse unterstrichen, dass die Funktionen von Glutathion-metabolischen Proteinen vom Stammhintergrund und den morphologischen Formen abhängen könnten. Mehrere Glutathion-Gene zeigten durchweg ähnliche Expressionsmuster über die getesteten Stammhintergründe hinweg, und wir postulierten, dass diese Gene die wichtigsten Enzyme kodieren und auf zelltypspezifische Weise funktionieren.

Die GST-Proteine spielen eine entscheidende Rolle bei der Entgiftung von Xenobiotika, bei denen es sich um Fremdstoffe handelt, die im Organismus nicht auf natürliche Weise produziert werden. In jüngster Zeit gelten Antimykotika als wichtige Xenobiotika für T. marneffei, und Arzneimittelresistenzen stellen weltweit ein großes medizinisches Problem dar. Aufgrund dieser Bedenken hinsichtlich der öffentlichen Gesundheit kamen wir zu dem Schluss, dass Gsts an der Entgiftung fremder Substanzen beteiligt sein könnten, was letztendlich zum Mechanismus der Resistenz gegen Pilzmedikamente beitragen könnte. Um zu untersuchen, ob die GSTs von T. marneffei an der xenobiotischen Reaktion beteiligt sind, wurde das synthetische Substrat 1-Chlor-2, 4-dinitrobenzol (CDNB) als xenobiotisches Modell ausgewählt, da es das Substrat für die meisten GST-Enzyme ist. Als ersten Schritt analysierten wir, ob die Gst-Gene als Reaktion auf Xenobiotika transkriptionell reguliert werden könnten. Wir behandelten die Schimmel- und Hefekulturen des T. marneffei-Stammes ATCC200051 1 Stunde lang mit CDNB (0,02 mM) und maßen die Transkriptmengen von TmGst1 bis TmGst10. In der Schimmelphase zeigte TmGst1 den höchsten Anstieg um fast das Dreifache im Vergleich zu unbehandelten Proben (Abb. 7a). In der Hefephase zeigte TmGst3 die höchste Hochregulierung und zeigte eine 3,5-fache Erhöhung der CDNB-Exposition (Abb. 7b). Unsere Daten zeigten, dass TmGst1 und TmGst3 phasenspezifisch transkriptionell auf CDNB reagierten.

Glutathion-S-Transferase-Genexpressionsprofil in T. marneffei, das unter Xenobiotika-Behandlung (CDNB) wächst. Konidien vom Stamm T. marneffei ATCC200051 wurden in Sabouraud-Dextrose-Brühe inokuliert und 3 Tage lang bei 25 °C oder 37 °C gezüchtet, um entweder die Schimmel- (a) bzw. die Hefephase (b) auszulösen. T. marneffei-Kulturen wurden entweder direkt geerntet (keine Behandlungskontrolle/normal) oder mit CDNB (0,02 mM) behandelt und 60 Minuten nach der Behandlung geerntet. RNA-Proben wurden extrahiert und einer cDNA-Synthese und einer quantitativen Echtzeit-PCR unterzogen. Das Experiment wurde in drei biologischen Replikaten durchgeführt. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Ausgewählte Gsts sind TmGst1-10. Statistisch signifikante Werte (*P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ns = nicht signifikant) sind angegeben.

Während der Besiedlung und Invasion des Wirts ist T. marneffei externem oxidativem Stress ausgesetzt, der von den Makrophagen des Wirts erzeugt wird. Um festzustellen, ob das Glutathionsystem von T. marneffei an der zellulären Reaktion auf einen externen oxidativen Stressor beteiligt ist, wurden die 72-Stunden-Schimmelpilz- und Hefekulturen des Stamms T. marneffei ATCC200051 2 mM H2O2 ausgesetzt. Nach 15, 30 und 60 Minuten H2O2-Behandlung wurden Kulturen gesammelt und die Genexpressionsniveaus analysiert. Für Gst-Gene haben wir uns entschieden, die Transkriptmengen von TmGst3 unter den anderen 20 Gst-Proteinen zu bewerten, da es in unserem Bericht und in der Studie von Lin et al. durchweg eine phasenspezifische Expression aufwies. Bemerkenswerterweise zeigte TmGst3 in Hefephasenkulturen 15 Minuten nach der H2O2-Exposition die höchste Gen-Hochregulierung, mit einem fünffachen Anstieg im Vergleich zur Kontrolle ohne Behandlung. (Abb. 8a). Allerdings waren die TmGst3-Expressionsniveaus 30 Minuten und 60 Minuten nach der H2O2-Exposition nicht mehr erhöht. Darüber hinaus waren die gpx1- und gcs1-Transkripte als Reaktion auf die H2O2-Behandlung signifikant erhöht. Dieses Ergebnis zeigte, dass die Gene für die Biosynthese, das Recycling und die Entgiftung von Glutathion innerhalb der ersten 15–60 Minuten schnell auf die Stressbedingungen reagierten (Abb. 8). Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse, dass T. marneffei im Allgemeinen die Expression von Glutathion-Genen induzierte, wenn die Zellen oxidativem Stress ausgesetzt waren.

Glutathion-metabolisches Genexpressionsprofil in T. marneffei, das unter oxidativen Stressbedingungen wächst. Konidien der Stämme T. marneffei ATCC200051 wurden in Sabouraud-Dextrose-Brühe inokuliert und 3 Tage lang bei 25 °C oder 37 °C gezüchtet, um entweder die Schimmelphase (a) oder die Hefephase (b) einzuleiten. T. marneffei-Kulturen wurden entweder direkt geerntet (keine Behandlungskontrolle/normal) oder mit H2O2 (2 mM) behandelt und 15, 30 und 60 Minuten nach der Behandlung geerntet. RNA-Proben wurden extrahiert und einer cDNA-Synthese und einer quantitativen Echtzeit-PCR unterzogen. Die Experimente wurden in drei biologischen Replikaten durchgeführt. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Ausgewählter Gst ist der TmGst3. Statistisch signifikante Werte (*P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ns = nicht signifikant) sind angegeben.

Glutathion und Glutathion-Stoffwechselproteine spielen eine Schlüsselrolle bei der Reaktion auf eine Vielzahl von Stresssituationen bei Pilzen27. Allerdings sind die Beiträge dieses Glutathionsystems bei thermisch dimorphen Pilzen größtenteils nicht charakterisiert39. Als intrazellulärer Krankheitserreger muss T. marneffei den in der phagosomalen Umgebung erzeugten Stress lindern. Frühere Studien berichteten über die Rolle enzymatischer Antioxidantien in T. marneffei, einschließlich Superoxiddismutase und Katalase-Peroxidase; Allerdings haben nur wenige Studien die Glutathion-Genexpressionsprofile charakterisiert19,40. Tatsächlich wurden bei dieser Pilzart noch nie Studien zur Störung des Glutathion-Gens durchgeführt. Mithilfe der NCBI- und Uniprot-Datenbanken identifizierten wir T. marneffei-Gene, die die wichtigsten Enzyme der Glutathion-Biosynthese, des Glutathion-Recyclings und der Glutathion-bezogenen Entgiftung kodieren. Um die Funktion des Glutathionstoffwechsels in verschiedenen Zelltypen zu verstehen, haben wir die Expressionsniveaus der Glutathionstoffwechselgene gemessen, wenn T. marneffei in Hefe, Schimmel und infektiösen asexuellen Konidien vorkommt. In unseren Analysen wurden mehrere Genexpressionsmuster entdeckt. Zunächst wurden die Transkriptmengen des Glutathion-Biosynthesegens TmGcs2 in Konidien von T. marneffei aus zwei verschiedenen Stammhintergründen und in der thermisch induzierten Hefeform des Stamms T. marneffei ATCC200051 nachgewiesen. Ebenso wurde das GSH2-Gen (das Gcs2-Homolog) des dimorphen menschlichen Pilzpathogens H. capsulatum in der Hefeform im Vergleich zur Schimmelpilzform stark exprimiert, was mit unserem Ergebnis übereinstimmt41. In S. cerevisiae wurde die Expression sowohl der GSH1- als auch der GSH2-Gene durch Hitzeschockbehandlung (41 °C) induziert34,35. Wie bereits erwähnt, ist eine erhöhte Temperatur von 25 bis 37 °C ein entscheidender Auslöser, der die Hefemorphologie in T. marneffei und H. capsulatum auslöst. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass der Glutathion-Biosyntheseweg auf hitzeinduzierten Stress reagiert, der während der morphologischen Umwandlung in dimorphen Pilzen auftreten kann.

Zweitens war das Glutathionperoxidase-Gen in Konidien stark akkumuliert und in der Hefeform von T. marneffei der Stämme ATCC200051 und ATCC18224 hochreguliert, war jedoch unter H2O2-Exposition nicht induzierbar. Während andere Pilzarten über mehrere Genkopien verfügen, die für Glutathionperoxidase kodieren, gibt es in T. marneffei nur ein Glutathionperoxidase-Homolog39. Beispielsweise gibt es in der Hefe S. cerevisiae drei Glutathionperoxidase-Homologe, GPX1, GPX2 und HYR1 (auch bekannt als GPX3 und ORP1). In C. albicans gibt es vier Homologe der Glutathionperoxidase: GPX3 (Homolog von S. cerevisiae GPX1), GPX31, GPX32 und GPX33 (GPX31-33 sind Homolog von ScHYR1)42,43. In S. cerevisiae waren die Expressionsniveaus des HYR1-Gens konstitutiv hoch und konnten durch keinen der getesteten Stressoren induziert werden44. Allerdings wurde das ScGPX1-Gen durch Glukosemangel induziert, während das ScGPX2-Gen durch oxidativen Stress induziert wurde44. Bei A. fumigatus wurde das hyr1-Gen bei H2O2-Behandlung mäßig induziert (Fold-Change < 2, p-Wert < 0,05;45). Bei C. albicans wurde nur das GPX31-Gen bei Exposition gegenüber oxidativem Stress stark induziert43. Diese Studien zusammen zeigen Unterschiede in der Transkriptionsregulation jeder Glutathionperoxidase, die für bestimmte Stressoren spezifisch sein und zwischen Pilzarten variieren könnten.

Gsts sind eine Familie multifunktionaler Enzyme, die eine wichtige Rolle bei der Stressreaktion und der Entgiftung einer Vielzahl endogener und exogener Verbindungen spielen. In der vorliegenden Studie wurden durch eine umfassende genomweite Suche insgesamt 20 TmGst-Genmitglieder identifiziert. Diese massive Ausweitung der Gsts in T. marneffei steht im Einklang mit der Diversifizierung der Gst-Proteine, die in Pilzen und anderen Organismen vorkommen33. Tatsächlich wurde der Begriff „GSTome“ so zusammengestellt, dass er die gesamte Sammlung aller GSTs und ihre Rollen in einem Organismus widerspiegelt46. Bei Pilzen reicht die Gst-Isoformenzahl von 4 Genkopien in der Basidiomycetenhefe Sporobolomyces roseus bis zu 44 Genkopien in den Braunfäulepilzen Postia placenta und Coniophora puteana33. Bemerkenswerterweise besteht kein Zusammenhang zwischen dem trophischen Modus der Pilze (z. B. saprophytischer, symbiotischer und pathogener Modus) und ihren Gst-Zahlen33.

Basierend auf der Evolutionsanalyse konnten wir die meisten TmGsts in die bekannte Gst-Klasse mit hohen Bootstrap-Werten einordnen. Die Ure2-Klasse besteht aus TmGst1, TmGst2, TmGst3, TmGst10 und TmGst15. Die GTT1-Klasse besteht aus TmGst5, TmGst6 und TmGst7. Die Theta-Klasse besteht aus TmGst8 und TmGst9. Die EF1B-Klasse besteht aus TmGst13. Die Zeta-Klasse besteht aus TmGst4, TmGst14, TmGst18 und TmGst19. Es ist jedoch allgemein bekannt, dass die Klassifizierung von Pilz-GSTomen aufgrund (i) der Einschränkung der Standardklassifizierungskriterien und (ii) der Zunahme der Anzahl und Funktionen von Pilz-GST schwierig war. Tatsächlich passen einige der TmGsts nicht ohne weiteres in die zuvor charakterisierten Pilzklassen28,47. In unserer Studie wurde beispielsweise das MAPEG TmGst16 in die Metaxin1/SAM35-Klasse mit niedrigeren Bootstrap-Werten eingeordnet, obwohl sie unterschiedliche Funktionsdomänen enthalten.

In mehrzelligen Organismen weisen Gsts eine funktionelle Spezifität für Organe und Gewebe auf, was ihrer Notwendigkeit für Wachstum und Entwicklung zugrunde liegt48,49,50,51. Bei T. marneffei wurden die TmGst-Genexpressionsniveaus zellzustandsspezifisch verändert9,10 (Diese Studie). Das TmGst6-Gen war in temperaturinduzierter Hefeform9 (diese Studie) stark hochreguliert. Diese TmGst6-Geninduktion in der Hefeform ist in drei verschiedenen Stammhintergründen konsistent und verstärkt die herausragende Funktion von TmGst6 in pathogenen Hefezellen. Mehrere Genexpressionsstudien zeigten, dass die Gene TmGst39 (diese Studie) und TmGst149,10 in der Hefeform herunterreguliert waren (dh in Schimmelpilzform stark exprimiert wurden), was darauf hindeutet, dass die Proteine TmGst3 und TmGst14 in der Schimmelpilzphase wichtig sind. Darüber hinaus zeigte das TmGst10-Gen die höchste Akkumulation in Konidien der T. marneffei-Stämme ATCC20051 und ATCC18224 (diese Studie). Der Rest der getesteten TmGst-Gene zeigte stammhintergrundspezifische Expressionsprofile. Insgesamt bestätigte unsere Identifizierung von 20 TmGsts und die Charakterisierung ihrer Genexpressionsprofile die gemeinsame Rolle von Gst bei Wachstum und Entwicklung sowohl auf zellulärer als auch auf Gewebe-/Organebene48,49,50,51.

Die Expressionsniveaus von Gst-Genen ändern sich normalerweise als Reaktion auf bestimmte Substrate oder Stressfaktoren. Bei der Exposition gegenüber Wasserstoffperoxid stellten wir fest, dass TmGst3 in der Hefephase im Vergleich zur Schimmelphase oder zu anderen Glutathion-Stoffwechselgenen stark hochreguliert war. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Induktion von Glutathion-S-Transferase-Genhomologen, die in anderen Pilzarten gefunden wurden. In S. cerevisiae wurden die GTT1- und GTT2-Gene während der diauxischen Verschiebung und der stationären Phase induziert, in der die Hefezellen mehr ROS-Spiegel akkumulierten und daher mehr oxidativem Stress ausgesetzt waren38. In S. pombe wurden die Gene gst1+, gst2+ und gst3+ während der stationären Phase und als Reaktion auf Wasserstoffperoxid hochreguliert52. Die gstA-, gstB- und gstC-Gene von A. fumigatus und das gstA-Gen von A. nidulans wurden alle als Reaktion auf die Behandlung mit Wasserstoffperoxid induziert53,54. Neben der Rolle bei der Reaktion auf oxidativen Stress werden viele Gst-kodierende Gene von Pilzen auch als Reaktion auf Schwermetalle, Xenobiotika oder andere Stressbedingungen hochreguliert. Beispielsweise wird die GST2-Genexpression von C. albicans unter Stickstoffmangel induziert,55 während die Gst-Gene von Aspergilli als Reaktion auf das Xenobiotikum CDNB induziert wurden53,54. Unser Ergebnis stimmte mit diesen Studien überein, da wir die hochregulierten Spiegel des TmGst1-Gens in der Schimmelpilzphase und des TmGst3-Gens in der Hefephase nach der CDNB-Behandlung nachweisen konnten. An der Resistenz gegen Antimykotika sind verschiedene Mechanismen beteiligt. Dennoch sind die Erkenntnisse über die entgiftende Wirkung von Gsts auf Antimykotika begrenzt. Bei Fusarium graminearum zeigte der gegen Benzimidazol resistente Mutant eine höhere Gst-Aktivität als der nicht resistente Stamm56. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass Gst an der Resistenz gegen Antimykotika bei F. graminearum beteiligt sein könnte. In T. marneffei wurden TmGst1 und TmGst3 als Reaktion auf CDNB transkriptionell hochreguliert, was darauf hindeutet, dass bestimmte Arten von TmGst-Proteinen das CNDB binden und entgiften können. Vermutlich könnten andere Arten von TmGst eine Rolle bei der Entgiftung anderer Xenobiotika, einschließlich Antimykotika, spielen. Zukünftige Experimente werden erforderlich sein, um festzustellen, welche Art von TmGsts an der Entgiftung und Resistenz gegen Antimykotika beteiligt sind.

Unsere Daten legen nahe, dass Glutathion-Stoffwechselgene transkriptionell reguliert werden, um ihre spezialisierten oder allgegenwärtigen Funktionen aufrechtzuerhalten. In S. cerevisiae ist Yap1 ein Transkriptionsfaktor, der die Expression der Gene GSH1, GSH2, GLR und GPX2 direkt hochreguliert35,37,57,58. ScHyr1 fungiert als Hydroperoxidsensor, bildet eine Disulfidbindung mit Yap1 und maskiert dadurch ein Yap1-Kernexportsignal59,60. Diese Wechselwirkung führt zur Retention von Yap1 im Zellkern, um auf Oxidation reagierende Gene hochzuregulieren61,62. In S. pombe steuern der Transkriptionsfaktor Pap1 (ScYap1-Homolog) und Atf1 die Transkriptionsregulation von Glutathion-Stoffwechselgenen unter Stressbedingungen63,64. Die Expression von gst1+ und gst2+ ist Pap1-abhängig, wohingegen die Induktion von gst3+ Atf1-abhängig ist52. Bei T. marneffei ist die Hochregulierung der TmGcs1- und TmGlr-Gene als Reaktion auf die oxidativen Stressoren H2O2, Menadion und NaNO2 in allen Wachstumsformen (Konidien, Schimmel und Hefe) von yapA (Yap1-Homolog) abhängig40. Außer den Genen TmGcs1 und TmGlr wurden in der Studie von Dankai et al. keine anderen Glutathion-Stoffwechselgene getestet. Darüber hinaus zeigt die atfA-Deletionsmutante (SpAtf1-Homolog) in T. marneffei zwar eine Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen oxidativen Stressfaktoren, es wurde jedoch nicht getestet, ob die metabolische Genexpression von Glutathion von aftA abhängt65. Aufgrund der verfügbaren Daten stellten wir die Hypothese auf, dass yapA oder/und atfA wahrscheinlich die wichtigsten Transkriptionsfaktoren sind, die die Expression von Glutathion-Stoffwechselgenen induzieren, über die in unseren aktuellen Studien berichtet wurde. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Mechanismen, die die Transkription der Glutathion-Homöostase-Gene in T. marneffei regulieren, vollständig zu entschlüsseln.

Zusammenfassend haben wir das Glutathion-Stoffwechselsystem im thermisch dimorphen Pilz T. marneffei charakterisiert. Mithilfe der homologen Sequenzsuche identifizierten wir Glutathion-Biosyntheseenzyme (Gcs1 und Gcs2), Glutathionperoxidase (Gpx1), Glutathionreduktase (Glr1) und eine Familie von Glutathion-S-Transferasen (Gsts). Es gibt 20 TmGsts (TmGst1-20), und die phylogenetische Analyse ergab die evolutionäre Konservierung von TmGsts mit anderen Klassen bekannter Pilz-Gst-Proteine. Basierend auf der evolutionären Verwandtschaft wurden die TmGsts in mindestens vier Klassen eingeteilt, darunter Ure2, GTT1, EF1B und Zeta. Eine umfassende Genexpressionsanalyse wurde in drei verschiedenen Zelltypen durchgeführt, darunter Konidien-, Schimmelpilz- und temperaturinduzierte Hefezellen. Die meisten Glutathion-Stoffwechselgene zeigten unterschiedliche Genexpressionsmuster, wenn sie in verschiedenen Zellphasen gezüchtet wurden. Da die Fähigkeit von T. marneffei, seine Morphologie zu ändern und den Makrophagen-Abtötungsprozess zu überleben, ein wichtiger Virulenzfaktor ist, könnte die Regulierung des Glutathion-Stoffwechselsystems möglicherweise das Überleben und den dimorphen Wechsel von T. marneffei während der Wirtsinvasion und bei Infektionen erleichtern. Somit wird diese Studie zum Verständnis der Pathobiologie von T. marneffei beitragen und Forschern dabei helfen, phasenspezifische Gene/Biomarker zu identifizieren.

Die T. marneffei-Stamm ATCC20051 (CBS119456) und FRR2161 (ATCC18224) wurden 10–14 Tage lang bei 25 °C auf Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) kultiviert, um Konidien zu erzeugen. Die Konidien wurden geerntet und 1 × 108 Konidien/ml wurden in 50 ml Sabouraud-Dextrose-Brühe (SDB) inokuliert. Die Kulturen wurden entweder bei 25 °C (Schimmelphase) oder 37 °C (Hefephase) unter kontinuierlichem Schütteln bei 200 U/min inkubiert. Nach 72 Stunden wurden die Kulturen durch 30-minütige Zentrifugation bei 4 °C und 7000 U/min gesammelt. Zur Vermeidung von oxidativem Stress wurden Kulturen in Schimmel- und Hefephasen 72 Stunden lang gezüchtet und 2 mM H2O2 15 Minuten, 30 Minuten und 1 Stunde lang unter kontinuierlichem Schütteln bei 200 U/min zugegeben. Zur xenobiotischen Behandlung wurden Kulturen in Schimmel- und Hefephasen 72 Stunden lang gezüchtet und 0,02 mM 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol (CDNB) (Sigma-Aldrich, Stadt, Land) 1 Stunde lang unter kontinuierlichem Schütteln bei 200 °C zugegeben U/min. Nach der angegebenen Inkubationszeit wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und einer Genexpressionsanalyse unterzogen.

Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzol®-Reagenz isoliert, mit DNase I behandelt und wie zuvor beschrieben in cDNA umgewandelt66. Quantitative Echtzeit-PCR wurde mit dem SYBR Green qPCR-Mix (Thunderbird SYBR Green Chemistry, TOYOBO, Osaka, Japan) durchgeführt. Als Referenzgen (interne Kontrolle) wurde ein Actin-Gen einbezogen. Alle in dieser Studie verwendeten Primer sind in Tabelle S1 aufgeführt. Die Berechnung eines relativen Ausdrucks wurde unter Verwendung von 2−(∆Ct) durchgeführt, wobei ∆Ct = Ct actin − Ct target). Der Student-T-Test und die statistische Signifikanz wurden mithilfe von Excel berechnet. Fehlerbalken geben die mit Excel berechnete Standardabweichung an.

Eine Heatmap, die die Transkripthäufigkeit und das Expressionsmuster angibt, wurde mit dem hierarchischen Clustering-Webtool HEATMAP (https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HEATMAP/heatmap.html) erstellt. Die log2-fachen Änderungswerte der relativen Ausdrucksniveaus (der 2−(∆Ct)-Wert) wurden zur Erstellung der Heatmap verwendet.

DNA-Sequenzen von Glutathion-Genen (gcs1, gcs2, gpx1, glr1 und gst) aus den Hefemodellen Saccharomyces cerevisiae wurden an das grundlegende lokale Alignment-Suchtool für Nukleotide (BLASTn) übermittelt, um nach Sequenzähnlichkeit mit dem T. marneffei-Stamm ATCC18224 zu suchen. Aminosäuresequenzen identifizierter Glutathion-Gene von T. marneffei und anderen Pilzhomologen wurden mit dem BLAST-Suchtool für Protein (BLASTp) erhalten. Funktionelle Domänen und Signaturmuster wurden mithilfe von Prosite (https://prosite.expasy.org/scanprosite/), SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/), KEGG (https://www.kegg) vorhergesagt .jp/kegg/kegg1.html) und Uniprot-Tools (https://www.uniprot.org/). Die Visualisierung der Gst-Funktionsdomänen wurde mit dem IBS 2.0-Tool67 (https://ibs.renlab.org) durchgeführt. Das Tool „Compute pI/Mw“ wurde verwendet, um das Molekulargewicht (Mw) und die isoelektrischen Punkte (PI) von Gst-Proteinen vorherzusagen (https://web.expasy.org/compute_pi/). Das Vorhandensein sekretorischer Signalsequenzen und die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen wurden mithilfe der SignalP- und WoLF-PSORT-Programme vorhergesagt68,69.

Das Clustal Omega-Programm wurde zur Durchführung des Proteinsequenz-Alignments eingesetzt (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Phylogenetische Bäume wurden in MEGA 11 mit der Neighbor-Joining-Methode unter Verwendung von 1000 Bootstraps als Phylogenietest für Gpx-Proteine und mit der Maximum-Likelihood-Methode unter Verwendung von 500 Bootstraps als Phylogenietest für Gst-Proteine erstellt. Der Baum wurde mit dem webbasierten Tool iTOL: Interactiv Tree of Life70 (https://itol.embl.de/) weiter dekoriert.

Genexpressionsdatensätze, die während der aktuellen Studie generiert und analysiert wurden, sind bei Figshare hinterlegt und verfügbar (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.23265335). Primersequenzen sind in Tabelle S1 aufgeführt. Die zur Erstellung einer Heatmap in Abb. S1 verwendeten Daten sind unter https://doi.org/10.3109/13693786.2012.678398 frei zugänglich. In Tabelle S3 sind nur spezifische Daten zur Gst-Genexpression zusammengefasst.

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Wir danken Phimchat Suwannaphong für die Unterstützung bei der anfänglichen Identifizierung des Glutathion-Gens und dem Primer-Design. Der Englischnachweis wurde freundlicherweise von Barbara Metzler vom English Language Team (CELT) der Chiang Mai University und Ryan Gentry Williams erbracht.

Diese Forschung wurde vom Forschungsfonds der Fakultät für Medizin finanziell unterstützt, Fördernr. 153-2564 und 002-2566.

Abteilung für Mikrobiologie, Medizinische Fakultät, Universität Chiang Mai, Chiang Mai, Thailand

Tanaporn Wangsanut, Panwarit Sukantamala und Monsicha Pongpom

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TW und MP konzipierten und überwachten die Studie; PS führte die Experimente durch; TW, PS und MP analysierten die Daten und erstellten die Abbildungen und Tabellen; TW und MP haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und die endgültige Fassung genehmigt.

Korrespondenz mit Monsicha Pongpom.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Wangsanut, T., Sukantamala, P. & Pongpom, M. Identifizierung von Glutathion-Stoffwechselgenen aus einem dimorphen Pilz Talaromyces marneffei und ihrer Genexpressionsmuster unter verschiedenen Umweltbedingungen. Sci Rep 13, 13888 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40932-w

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Eingegangen: 18. Mai 2023

Angenommen: 18. August 2023

Veröffentlicht: 24. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40932-w

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