Eine neuartige Strategie zum Screening von Mutationen in der Spannung

Infectious Diseases of Poverty Band 12, Artikelnummer: 74 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die aktuelle Präventions- und Kontrollstrategie für Aedes albopictus stützt sich stark auf ein umfassendes Management, wie z. B. Umweltmanagement und Chemikalienkontrolle. Allerdings hat die breite Anwendung von Pyrethroiden die Entwicklung einer Insektizidresistenz erleichtert, vor allem durch Mutationen im spannungsgesteuerten Natriumkanal-Gen (VGSC). Diese Studie zielt darauf ab, eine neuartige Strategie zum Nachweis von Mutationen im VGSC-Gen in Ae zu entwickeln. Albopictus mithilfe der Multiplex-PCR-Massenspektrometrie (MPCR-MS)-Minisequenzierungstechnologie.

Wir haben eine neue Strategie zum Nachweis von Mutationen im VGSC-Gen in Ae entwickelt. Albopictus mithilfe der MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie. Zuerst wurden MPCR-Amplifikation und Massensondenverlängerung (MPE) verwendet, gefolgt von der Einzelnukleotid-Polymorphismus-Massenspektrometrie (SNP), die den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Mutationsstellen des VGSC-Gens in 96 Ae-Proben ermöglicht. albopictus. Insgesamt 70 wild gesammelte Ae. albopictus wurden verwendet, um die Leistung der Methode durch Vergleich mit anderen Methoden zu bewerten.

Drei Zielstellen (1016, 1532, 1534) im VGSC-Gen können gleichzeitig durch doppelte PCR-Amplifikation in Kombination mit Matrix-unterstützter Laser-Desorption-Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometrie nachgewiesen werden, wodurch eine Nachweisgrenze von 20 fg/μl erreicht wird. Wir haben diese Methode auf 70 wild gesammelte Ae angewendet. albopictus und die erhaltenen Genotypen stimmten mit den Ergebnissen der Routinesequenzierung überein, was auf die Genauigkeit unserer Methode schließen lässt.

Die MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie bietet einen empfindlichen Ansatz mit hohem Durchsatz für Ae. albopictus VGSC-Genmutationsscreening. Im Vergleich zur herkömmlichen Sequenzierung ist diese Methode wirtschaftlich und zeitsparend. Es ist von großem Wert für die Überwachung der Insektizidresistenz in Gebieten mit einem hohen Risiko für durch Vektoren übertragene Krankheiten.

Aedes albopictus ist ein wichtiger Vektor für die Übertragung von Arboviren, einschließlich Dengue-Virus, Chikungunya-Virus und Zika-Virus [1,2,3]. Als eine der invasivesten Mückenarten mit schneller Fortpflanzung und aggressivem Verhalten [4, 5] ist Ae. albopictus hat seine Präsenz in mehr als 70 Ländern weltweit erfolgreich ausgeweitet [6]. Derzeit ist Ae. Albopictus wird durch eine Kombination aus biologischen, chemischen und physikalischen Methoden bekämpft, und chemische Insektizide werden hauptsächlich zur direkten Abtötung von Mücken eingesetzt [7, 8]. Von diesen Insektiziden werden Pyrethroide aufgrund ihres breiten Wirkungsspektrums, ihrer hohen Wirksamkeit und ihrer geringen Toxizität für Säugetiere am häufigsten eingesetzt [9, 10].

Spannungsgesteuerte Natriumkanäle, die vom VGSC-Gen kodiert werden, sind das Hauptziel von Pyrethroid-Insektiziden. Mutationen im VGSC-Gen könnten die Anfälligkeit für Ae verringern. albopictus gegen Pyrethroide, was zu einer Knockdown-Resistenz führt [11]. Die erste Sense-Mutation (F1534C) wurde 2011 in Singapur entdeckt [12]. Die Sequenz der VGSC-Genorte in Ae. albopictus wird anhand der Nummerierung der Natriumkanäle in Musca Domestica bestimmt [13]. Im VGSC-Gen in Ae wurden mehrere Mutationsstellen gefunden. Albopictus [14,15,16,17,18,19,20] und drei von ihnen (1016, 1532 und 1534) sind nachweislich mit Knockdown-Resistenz verbunden [11]. Die Mutation von GTA zu GGA an der Codonstelle 1016 führt zu einem Aminosäurewechsel von Valin (V) zu Glycin (G) [21]. Am Locus 1532 kann ATC (Isoleucin, I) zu ATA (Isoleucin, I) oder ACC (Threonin, T) mutiert werden [14]. Am Locus 1534 kann das Wildtyp-TTC (Phenylalanin, F) synonym zu TTT (Phenylalanin, F) oder nicht-synonym zu TCC/TCG (Serin, S), TGC (Cystein, C), TTG/CTG/CTC mutiert sein /TTA (Leucin, L), CGC (Arginin, R) oder TGG (Tryptophan, W) [12, 16, 18,19,20].

Derzeit ist der Nachweis von Mutationen im VGSC-Gen bei Ae. albopictus beruht auf DNA-Sequenzierung oder allelspezifischer PCR (AS-PCR). Die DNA-Sequenzierung wird am häufigsten verwendet und gilt als Goldstandard für den Nachweis von VGSC-Mutationen. Allerdings ist die DNA-Sequenzierungstechnologie aufgrund ihres hohen Kosten- und Zeitaufwands nicht für Studien mit einer großen Anzahl von Proben geeignet [19]. AS-PCR [19] wurde auch zum Nachweis von Mutationen im VGSC in Ae verwendet. albopictus ist jedoch nur für den Single-Site-Nachweis mit relativ geringer Spezifität geeignet. Daher eine schnelle, genaue, wirtschaftliche und standortübergreifende Nachweismethode für VGSC-Mutationen in Ae. Albopictus ist ein dringender Bedarf.

Matrixunterstützte Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) wird häufig zum Nachweis von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) eingesetzt. Der Hauptprozess dieser Methode besteht darin, DNA aus Ae zu extrahieren. Albopictus und amplifizieren Gene, die SNP-Ziele enthalten, durch Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion (MPCR). Anschließend ist die Massensonde darauf ausgelegt, die erkannten SNP-Stellen zu erweitern. Schließlich wird das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) der durch MALDI-TOF-MS identifizierten erweiterten Basis verwendet, um den Basistyp des Standorts zu bestimmen. Diese Methode wird auch MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie genannt [22]. Derzeit wird es in der Klinik häufig eingesetzt (z. B. mikrobiologische Tests und Analysen) [23] und ist für die SNP-Analyse sehr vielversprechend, da es schnell und gleichzeitig mehrere Ziele erkennen kann [22, 24].

In dieser Studie wurde die MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie verwendet, um 17 Genotypen gleichzeitig an drei VGSC-Genmutationsstellen in Ae zu erkennen. albopictus. Die etablierte Methode der MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie wurde verwendet, um das VGSC-Gen in 70 Ae-Proben nachzuweisen. Albopictus wurde im Feld gefangen und die Zuverlässigkeit der Methode wurde bewertet.

Insgesamt 13 Ae. Albopictus-Proben wurden verwendet, um die Methode der MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie zu etablieren. Im Jahr 2021 wurden Proben von BJ1 vom National Institute for Infectious Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, erhalten. BJ1, die Wildtyppopulation, die anfällig für Pyrethroide ist, diente in dieser Studie als Kontrollmücken (BJ1: V/ V, I/I, F/F). Die mutierten oder resistenten Mückenpopulationen wurden im Jahr 2020 in sieben Städten (Bezirken) von sechs Provinzen in China gesammelt: YB2, MS32, LC1, LC7, MS5, YB8, HK33, LY6, SZ48, JN17, LY55 und YB6.

Weitere 70 wild gesammelte Proben mit unbekanntem Mutationsstatus im VGSC-Gen, Probennummern HNLY1–HNLY30 und HNXC1–HNXC40, wurden verwendet, um die Leistung der neu etablierten MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie zu testen. Informationen zur Probenentnahme finden Sie in Tabelle 1.

Die DNA wurde unter Verwendung eines genomischen DNA-Extraktionskits für Mikrogewebe mit Magnetkügelchen (Bioteke Corporation, Wuxi, China) extrahiert. Die drei untersuchten VGSC-Mutationsstellen (1016, 1532, 1534) wurden gemäß veröffentlichten Arbeiten sequenziert (12, 21). Insgesamt 13 Proben wurden verwendet, um die Methode der MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie zum Nachweis von 14 Mutationsgenotypen (V/G, G/G, I/T, T/T, F/S, S/S, F/) zu etablieren. C, C/C, F/L, L/L, S/C), wie in Tabelle 2 gezeigt. Die 70 wild gesammelten Proben wurden zur Methodenvalidierung verwendet und Routinesequenzierung wurde verwendet, um VGSC-Gene in den Proben zu erkennen. Eine Zusatzdatei zeigt dies detaillierter (siehe Zusatzdatei 1).

Für das Primerdesign wurde die Primer Premier-Software (http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/) verwendet. Zwei PCR-Primersätze wurden entwickelt, um die drei VGSC-Zielstellen für die Multiplex-PCR zu amplifizieren (Tabelle 3). Die Länge der Primer lag zwischen 18 und 22 bp, wobei am 5'-Ende jedes Primers eine 10 bp lange feste Sequenz (ACGTTGGATG) hinzugefügt wurde.

MALDI-TOF-MS-Qualitätsunterschiedssonden für Mutationsstellen wurden mithilfe der genetischen Locus-Analysesoftware IntelliBio (V2.0, IntelliBio, Qingdao, China) entwickelt (Tabelle 4). Die Länge der Massensonde lag zwischen 17 und 28 bp. Das Molekulargewicht wurde auf 4–9 kDa mit einem minimalen Unterschied von 16 Da zwischen diesen Sonden ausgelegt. Die Sonden vg1016, fl15341, sc1534 und fl15342 können in einem Reaktionsrohr (als Rohr A bezeichnet) verlängert werden, und die Sonden it1532, fl15341-2 und sc1534-2 können in einem anderen Reaktionsrohr (als Rohr B bezeichnet) verlängert werden.

In Ae. Albopictus wurde die Analysemethode unter Verwendung der Wildtyp- und mutierten VGSC-Gene als Vorlagen entwickelt. Als Blindkontrolle diente Vollpuffer ohne Template-DNA (anstelle der Template-DNA wurde nukleinsäurefreies Wasser verwendet). Der Arbeitsablauf umfasste hauptsächlich DNA-Extraktion, Multiplex-PCR-Amplifikation, Massensondenverlängerung (MPE), MALDI-TOF-MS-Datenerfassung und QuanSNP-Analyse. Die Ergebnisse jedes Sondennachweises wurden gesammelt, der Genotyp an jeder Stelle wurde bestimmt und dann konnte die Mutation des VGSC-Genlocus bestimmt werden (Abb. 1).

Arbeitsablauf der MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie zur Erkennung von Aedes albopictus-VGSC-Mutationen. MALDI–TOF Matrixunterstützte Laserdesorptionsionisation–Flugzeit, SNP Einzelnukleotidpolymorphismus, VGSC Spannungsgesteuerter Natriumkanal

DNA wurde aus dem gesamten Gewebe von Ae extrahiert. albopictus unter Verwendung eines 96-Well-Magnetkügelchen-Mikrozell-/Gewebe-Genom-DNA-Extraktionskits (Bio Teke, Wuxi, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die extrahierte DNA wurde bei –20 °C gelagert.

Der MPCR kann zwei DNA-Fragmente gleichzeitig amplifizieren, wobei sich 1016 Stellen in einem DNA-Segment befinden. Die Stellen 1532 und 1534 befanden sich in einer anderen DNA-Sequenz. Das MPCR-Gerät war das gleiche wie das gewöhnliche Sequenzierungs-PCR-Gerät. Das MPCR war ein 10-μl-Reaktionssystem, einschließlich 2 × EasyTaqPCR Super Mix 5 μl, Primer (1016-F, 1016-R, 3234-F, 3234-R) bei 10 μmol/L jeweils 0,5 μl, DNA-Matrize 2 μl, und ddH2O 1 μl. Die Reaktionsbedingungen waren 5 Minuten lang 94 °C; 35 Zyklen mit 94 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; 72 °C für 8 Min.; und Lagerung bei 4 °C.

Nach mehreren PCRs wurde ein Verdau mit alkalischer Phosphatase (SAP) aus Garnelen durchgeführt, um freie desoxygenierte Nukleosidtriphosphate (dNTPs) zu eliminieren. Das Reaktionssystem umfasste 5 μl PCR-Produkte und 2 μl SAP-Gemisch (1,53 μl ddH2O, 0,17 μl SAP-Puffer, 0,3 μl SAP-Enzym); Die Reaktionsbedingungen waren 37 °C für 40 Minuten, 85 °C für 5 Minuten und Lagerung bei 4 °C.

MPE wurde durch Single-Base-Erweiterung von SAP-Produkten und gemischten Massensonden durchgeführt. Das Reaktionssystem umfasste 7 μl SAP-Verdauungsprodukte und 4 μl Massensondenmischung (1 μl E-ddNTPmix, 1,4 μl Massenpuffer, 0,6 μl Massenenzym, 1 μl Massensonde). Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 95 °C für 30 s, gefolgt von 52 °C für 5 s, 80 °C für 5 s und 5 Zyklen, und dann wurde der gesamte Prozess für 40 Zyklen wiederholt, bevor 72 °C für 3 min und schließlich bei 4 °C gelagert.

Zur Entsalzung und Reinigung wurde dem MPE-Produkt eine entsprechende Menge Harz zugesetzt. Zuerst wurden 14 μl entionisiertes Wasser in jede Reaktionsvertiefung gegeben und dann das Harz hinzugefügt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1006,2 × g für 1 Minute, um zu verhindern, dass das Harz an der Röhrchenwand haftet. Die Probenplatte wurde 30 Minuten lang in einem Flip-Mischer bei 10,1 × g mit Harz vermischt. Nach dem Mischen wurde die Probe 1 Minute lang bei 1006,2 × g zentrifugiert und der Überstand getestet.

Schließlich wurden MPE-Produkte durch MALDI-TOF-MS nachgewiesen. Die OligoPlate-Zielplatte und die Matrixlösung (3-Hydroxypyridin-2-carbonsäure: 3-HPA) wurden entfernt, die Matrixlösung wurde vor der Verwendung gründlich gemischt, vorzugsweise 2 Minuten lang beschallt, und eine Mischung aus Matrix und Probenüberstand wurde hergestellt ein Volumenverhältnis von 1:1. 3-HPA (1 μl) wurde in die Mitte des Probenziels getropft. Dann wurde 1 μl gereinigter Überstand mit 1 μl 3-HPA gemischt. Eine 1-μl-Mischung wurde auf die Substratzielplatte gegeben und trocknen gelassen. Anschließend wurde die kristallisierte Probe mittels MALDI-TOF-MS getestet. Das Verhältnis der Masse geladener Ionen zu ihrer Ladung (m/z) wurde analysiert, um zwischen verschiedenen Sonden und Sondenverlängerungen in der getesteten Substanz zu unterscheiden, und dann wurde die Basis an der Verlängerungsposition bestimmt. Die Erkennungsergebnisse der Standorte wurden als Excel-Tabelle exportiert.

Details finden Sie in unseren bisherigen Studien zum Nachweis von COVID-19 und Mycoplasma pneumoniae [22, 24].

Das DNA-Plasmid ohne Mutationen im VGSC-Gen wurde synthetisiert und zur Bestimmung der niedrigsten Nachweisgrenze (LDL) dieser Methode verwendet. Das DNA-Plasmid wurde von Sangon Biotech (Shanghai, China) synthetisiert und der Träger war pUC57. Die in dieser Studie identifizierten Primer wurden für die Gensynthese der amplifizierten Sequenzen verwendet, einschließlich dreier Mutationsstellen des VGSC-Gens, und insgesamt wurden 4 μg Trockenpulverplasmid synthetisiert. Die ursprüngliche Nukleinsäurekonzentration wurde quantifiziert und entlang eines Gradienten mit sechs Konzentrationen (2 pg/μl, 200 fg/μl, 20 fg/μl, 2 fg/μl, 200 ag/μl, 20 ag/μl) und anderen verdünnt Die Reaktionsbedingungen blieben unverändert.

Die etablierte MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie und die konventionelle Sequenzierungsmethode wurden an 70 wilden Ae getestet. albopictus gesammelt in der Provinz Henan, China.

Für die statistische Analyse wurde Excel 2021 (Microsoft, Washington, USA) verwendet. Die Probenerkennungsergebnisse wurden von MALDI-TOF MS im Excel-Format (Intelligene Biosystems, IntelliBio, Qingdao, China) erhalten und anschließend wurde eine deskriptive statistische Analyse durchgeführt.

Die drei VGSC-Zielstellen (1016, 1532 und 1534) wurden durch Doppel-PCR amplifiziert. Die ursprünglichen m/z-Peaks der sieben verwendeten Massensonden (vg1016, it1532, fl15341, fl15341-2, sc1534, sc1534-2, fl15342) betrugen 5924,8 ± 3,0, 5102,4 ± 3,0, 7162,6 ± 3,0, 6313,2 ± 3,0, 652 0,2 ± 3,0, 7210,8 ± 3,0 bzw. 5253,4 ± 3,0 (Massenfehler weniger als 500 mg/L, dasselbe unten; siehe Zusatzdatei 2a). Die m/z-Peaks der sieben bei der Mass Probe Extension (MPE) verwendeten Sonden betrugen 6221,8 ± 3,0, 6197,8 ± 3,0, 5444,4 ± 3,0, 5375,4 ± 3,0, 7459,6 ± 3,0, 7475,6 ± 3,0, 6655,2 ± 3,0, 6586,2 ± 3 .0, 6817,2 ± 3,0, 6833,2 ± 3,0, 6793,2 ± 3,0, 7552,8 ± 3,0, 7483,8 ± 3,0, 7523,8 ± 3,0, 5566,4 ± 3,0, 5526,4 ± 3,0, 5595,4 ± 3,0 und 5550 .4 ± 3,0, und die erweiterten Basen waren T, G , T, C, T, C, T, C, T, C, G, T, C, G, C, G, A und T (siehe Zusatzdatei 2b). Für die Blindkontrolle ohne DNA-Vorlage sind die Peaks in der Massensondenverlängerung in der Zusatzdatei 2 angegeben. c. Eine Zusatzdatei zeigt dies detaillierter [siehe Zusatzdatei 2].

Zur besseren Veranschaulichung der Zusatzdatei 2 wird eine ausführliche Erläuterung am Beispiel der Probe YB2 gegeben, wie in Abb. 2 dargestellt. Für Standort 1016 ist der Wildtyp-Homozygoten-Genotyp GTA/GTA, wobei die zweite Base T sein kann zu G mutiert. Der vg1016-Sondennachweis ergab zwei Peaks, die jeweils T und G entsprachen, was auf Wildtyp/mutierte heterozygote GTA/GGA schließen lässt. Für Standort 1532 ist der Wildtyp-Homozygote-Genotyp ATC/ATC, wobei das zweite Codon T zu C mutieren kann. Das Erkennungsergebnis der it1532-Sonde ist T, was auf eine Wild-Homozygote (ATC/ATC) schließen lässt. Für die Stelle 1534 ist die Wildtyp-Homozygote TTC/TTC, und es wurde berichtet, dass alle drei Basen in diesem Codon polymorph sind. Das Nachweisergebnis für die fl15341/fl15341-2-Sonde ist T, für sc1534/sc1534-2 ist T/G und für die fl15342-Sonde ist C, was darauf hindeutet, dass dieser Locus-Genotyp ein Wildtyp/mutierter heterozygoter TTC/TGC-Genotyp ist . Die umfassenden Nachweisergebnisse zeigen die spezifischen Genotypen von drei Loci des VGSC-Gens in der Probe.

Peaks der Zielstelle der Probe (YB2) der Massensondenerweiterung. Das Erkennungsergebnis der vg1016-Sonde ist T/G. Das Erkennungsergebnis der Sonde it1532 ist T. Das Erkennungsergebnis der Sonde fl15341/FL15341-2 ist T. Das Erkennungsergebnis der Sonde sc1534/SC1534-2 ist T/G. Das Erkennungsergebnis der Sonde fl15342 ist C

Die VGSC-Genorte von 13 Ae. Albopictus-Mücken wurden mithilfe unserer MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologiemethode genau identifiziert, was mithilfe der Gensequenzierung bestätigt wurde (Tabelle 5).

Nach der Optimierung betrugen die Endkonzentrationen der sieben Massensonden 8,30 μmol/L (vg1016), 6,87 μmol/L (it1532), 10,12 μmol/L (fl15341), 8,91 μmol/L (fl15341-2), 9,22 μmol/L (sc1534f), 10,18 μmol/L (sc1534-2) und 7,15 μmol/L (fl15342).

Abbildung 3a–c zeigt das m/z der sieben Massensonden ohne Expansion, den Peak der 7 Massensonden für die Erweiterungszielstelle bei unterschiedlichen Konzentrationen bzw. die 7 Massensonden mit Expansion für die Blindkontrolle. Die Nachweisgrenzen der sieben Massensonden (vg1016, it1532, fl15341, fl15341-2, sc1534, sc1534-2, fl15342) lagen bei 200 ag/μl, 200 ag/μl, 2 fg/μl, 200 ag/μl, 2 fg /μl, 200 ag/μl bzw. 20 fg/μl. Die Gesamtnachweisgrenze aller Standorte in der MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie betrug 20 fg/μl, wenn die verdünnte Konzentration der synthetischen DNA-Plasmide ohne die VGSC-Genmutation verwendet wurde (Abb. 3).

Nachweisgrenze von sieben Massensonden: ein MS-Peak von sieben Massensonden ohne Erweiterung; b die Konzentration der Zielort-Peaks der Massensondenverlängerung. c Blindkontrolle, ohne DNA-Template-Zielstellen-Peaks aus der Massensondenverlängerung

Die mit der MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie erhaltenen Nachweisergebnisse für 70 Proben stimmen mit den Sequenzierungsergebnissen überein. Die Genotypen der drei VGSC-Genorte in jeder Probe können mit unserer Methode korrekt identifiziert werden (Tabelle 6). Eine Zusatzdatei zeigt dies detaillierter (siehe Zusatzdatei 3).

Inmitten des raschen Auftauchens neuer Mutanten der Ae. Albopictus-VGSC-Gen versuchen Forscher, zusätzlich zur herkömmlichen DNA-Sequenzierung schnelle und bequeme Nachweismethoden zu entwickeln. Die bestehende Technologie kann nicht alle Mutationen gleichzeitig erkennen. PCR in Verbindung mit Sequenzierungstechnologie der ersten Generation gilt derzeit als Goldstandard für den Nachweis von VGSC-Mutationen bei Ae. Albopictus, der zwei PCRs erfordert, um das Zielgen zu amplifizieren, gefolgt von einer Sequenzierung der ersten Generation. Anschließend müssen diese identifizierten Mutationsstellen manuell untersucht werden, was ein komplizierter, zeitaufwändiger und kostspieliger Prozess ist. Darüber hinaus ist AS-PCR anfällig für Kontaminationen und weist eine geringe Spezifität auf [19, 25], was sie für den Nachweis mehrerer Proben ungeeignet macht. Im Gegensatz dazu konnte die MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie, die wir in dieser Studie entwickelt haben, innerhalb von sieben Stunden mehrere Mutationsstellen im VGSC-Gen in 96 Proben erkennen. Es kann gleichzeitig drei Mutationsstellen (Loci 1016, 1532 und 1534) erkennen und den mutierten Genotyp und die entsprechende Aminosäuresequenz identifizieren. Diese Technologie wurde zum Nachweis von COVID-19 und Mycoplasma pneumoniae eingesetzt [22, 24]. Ae. albopictus ist ein mehrzelliger eukaryontischer Organismus. Im Vergleich zu unseren früheren Studien umfasste diese Studie die DNA-Extraktion von Ae. Albopictus statt RNA-Extraktion und das Design von Primzahlen und Sonden für die Zielstellen. Die DNA-Extraktion ist im Vergleich zur RNA-Extraktion relativ einfach. Mittlerweile sind die VGSC-Mutationsstellen von Ae. albopictus waren in dieser Studie weniger häufig als Mutationen, die in anderen Mikroorganismen untersucht wurden, und das Design von Primern und Sonden war weniger anspruchsvoll.

Die hier entwickelte Methode hat gegenüber herkömmlichen Methoden mehrere Vorteile. Erstens erfordert die MPCR-MS-Minisequenzierung weniger PCR-Produkte und weniger Sequenzierung als herkömmliche PCR in Verbindung mit Sequenzierung. Das herkömmliche PCR-System ist ein 25-μl-System [12, 21], während unsere neu etablierte Methode nur ein 10-μl-System ist, was den Verbrauch von Reagenzien und Verbrauchsmaterialien erheblich reduziert. Die in dieser Studie etablierte Methode reduzierte die Kosten des Experiments erheblich, was in weniger entwickelten Ländern in Asien, Afrika und Lateinamerika von entscheidender Bedeutung ist [26,27,28], wo durch Mücken übertragene Infektionskrankheiten wie das Dengue-Fieber weit verbreitet sind. Chikungunya und Zika [11]. Die geringen Kosten und der Komfort machen unsere Methode zu einer großartigen Anwendung.

Diese Methode basiert auf dem Nachweis von Massensonden nach der PCR-Amplifikation, die in dieser Studie eine hohe Genauigkeit ohne Fehlidentifizierung zeigte. Die von uns verwendeten Proben waren ein Wildtyp-Homozygot, fünf Wildtyp- und mutierte Heterozygoten, vier homozygote Mutanten und ein mutierter Heterozygot (Tabelle 2). Wir haben diese Methode auch auf 70 wild gesammelte Proben angewendet. Die Nachweisergebnisse aller Proben stimmen mit den Sequenzierungsergebnissen überein, was auf die hohe Genauigkeit unserer Methode beim Testen von Proben schließen lässt. Zunächst zeigten die Detektionsergebnisse der MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie die Base an der gemessenen Position nach jeder Sondenverlängerung, und dann konnte der Genotyp jeder VGSC-Genmutationsstelle bestimmt werden. Schließlich konnten die Genotypen der drei VGSC-Genorte in jeder Probe bestimmt werden. Die Genotypen der drei Standorte wurden gemäß unseren Beurteilungsregeln (Tabellen 5, 6) korrekt identifiziert, was mit den Sequenzierungsergebnissen übereinstimmte. Die Zuverlässigkeit der Methode wurde durch die Nachweisproben überprüft, die darauf hindeuteten, dass die Methode einen Anwendungswert hat.

Unsere Methode weist außerdem eine hohe Empfindlichkeit auf. Im Vergleich zu Nachweismethoden, die auf herkömmlicher PCR oder Sequenzierungstechnologie der ersten Generation basieren, erfordert die MPCR-MS-Minisequenzierung weniger PCR-Produkte bei gleichzeitig hoher Empfindlichkeit. Als LDL dieser Methode haben wir 20 fg/μl verwendet. Die Nachweisgrenze variiert jedoch je nach Sonde. Beispielsweise lag die Nachweisgrenze von fl15341 nach Verlängerung der Massensonde bei 2 fg/μl, während die von fl15342 nur 20 fg/μl Kopien betrug. Obwohl sich diese beiden Sonden im selben PCR-Amplifikationsfragment befinden, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Sondenverlängerungseffizienz von fl15342 viel geringer war als die von fl15341.

Mit dieser Methode können nicht nur 17 Genotypen an den drei in dieser Studie berücksichtigten Standorten nachgewiesen werden, sondern auch darauf zugeschnitten werden, andere gemeldete Aminosäureveränderungen wie TCG(S)-, CGC(R)- und TGG(W)-Mutationen am 1534-Lokus zu erkennen [ 20]. Wenn die Sondenerkennungsergebnisse von fl15341-2, c1534-2 und fl15342 T, C und G waren, wurde der Genotyp als S/S (TCG/TCG) bestätigt. Darüber hinaus ist diese Methode erweiterbar und kann zum Nachweis neuer mutierter Genotypen an zuvor identifizierten polymorphen Loci verwendet werden. Wenn eine neue Mutationsstelle entdeckt wird, kann der Nachweis durch Hinzufügen einer entsprechenden Sonde zur neuen Mutationsstelle erfolgen.

Allerdings weist diese Methode einige Einschränkungen auf. Zunächst wird die 3'-terminale Sequenz der Verlängerungssonde festgelegt und die Qualität der Sonde wird maßgeblich von der Basensequenz in der Nähe der Nachweisstelle beeinflusst [22]. In dieser Studie wurde festgestellt, dass bei der Anlagerung der Sonde an den Matrizenstrang die Codon-Fehlpaarung zwischen der Sonde und dem Matrizenstrang zu einer ineffizienten Detektion führt. Wenn eine Fehlpaarung auftritt, ist es umso wahrscheinlicher, dass die Erkennung ineffizient ist, je näher sie am erkannten Codon liegt. Wenn beispielsweise der Locus 1534 (TCC/TCC) in der MS5-Probe getestet wird, ist die Mutante aufgrund der Mutationsänderung des zweiten Codons T zu C homozygot. Für das erste Codon wird die Sonde fl15341 (umgekehrtes Design) nachgewiesen. und das 3'-terminale Codon der Sonde ist A, was nicht mit dem zweiten Codon C der MS5-Probe übereinstimmt, was dazu führt, dass sich diese Sonde nicht verlängern lässt (Zusatzdatei 2b MS5-A). Um dieses Problem zu lösen, kompensiert die Sonde fl15341-2 (Forward-Design) das Fehlen der Sonde fl15341 (Zusatzdatei 2b MS5-B). In ähnlicher Weise gleicht die Sonde sc1534-2 das Fehlen der Sonde sc1534 aus. Diese Schlussfolgerung ist jedoch nicht absolut. Beim Nachweis von Locus 1534 (CTC/CTC) der SZ48-Probe wurde beispielsweise die sc1534-2-Sonde in Vorwärtsrichtung entworfen und das 3'-terminale Codon war A, was nicht mit dem ersten Codon C übereinstimmt. Das zweite Codon T wurde trotzdem korrekt erkannt (Zusatzdatei 2b SZ48-B). Kurz gesagt: Wenn die Sonde mit dem Matrizenstrang verknüpft wird, kann die Codon-Fehlpaarung zwischen der Sonde und dem Matrizenstrang zu einer ineffizienten Detektion führen. Zweitens gibt es TCG(S)-, CGC(R)- und TGG(W)-Mutationen am Locus 1534, die in dieser Studie aufgrund des Fehlens solcher Proben mit diesen Genotypen nicht getestet wurden.

Die MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie ist eine neuartige und einfache Methode zum Nachweis von VGSC-Genmutationen in Ae. albopictus. Aufgrund der hohen Genauigkeit, der hohen Empfindlichkeit, der Zeitersparnis und der wirtschaftlichen Vorteile dieser Technologie bietet sie ein großes Potenzial für die Mückenüberwachung, insbesondere in asiatischen, afrikanischen und lateinamerikanischen Ländern, die stark von durch Insekten übertragenen Infektionskrankheiten betroffen sind.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

Spannungsgesteuerter Natriumkanal

Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion

Multiplex-PCR-Massenspektrometrie-Minisequenzierungstechnologie

Matrixunterstützte Laserdesorptionsionisation – Flugzeitmassenspektrometrie

Einzelnukleotidpolymorphismus

Allelspezifische PCR

Masse-zu-Ladungs-Verhältnis

Alkalische Phosphatase von Garnelen

Desoxygenierte Nukleosidtriphosphate

Niedrigste Nachweisgrenze

3-Hydroxypyridin-2-carbonsäure

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken allen Teilnehmern dieser Studie.

Diese Forschung wurde vom National Science and Technology Major Project of China (Nr. 2018ZX10101002-002) finanziert.

National Key Laboratory of Intelligent Tracking and Forecasting for Infectious Diseases, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Peking, 102206, Volksrepublik China

Qunzheng Mu, Xin Zhao, Wenyu Li, Xinchang Lun, Yiguan Wang, Dongdong Hua, Qiyong Liu, Di Xiao und Fengxia Meng

Weifang No. 2 People's Hospital, Weifang, 261000, Shandong, Volksrepublik China

Qunzheng Mu

Weifang Medical College, Weifang, 261000, Shandong, Volksrepublik China

Fengfeng Li

Beijing Daxing District Center for Disease Control and Prevention, Peking, 102600, Peking, Volksrepublik China

Xinxin Zhou

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Datenerfassung, QZM, XZ, FFL, XXZ, XCL, WYL, DDH und FXM. Datensortierung und -analyse, QZM. Finanzierungsakquise, DX und XMF. Methodik, Software, QZM. Aufsicht, FXM, YGW und QYL. Entwurfsschreiben, QZM. Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, YGW, XZ, DX und FXM. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt. QZM und XZ haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen. Die Reihenfolge der Autoren wurde sowohl alphabetisch als auch nach zunehmendem Dienstalter festgelegt.

Korrespondenz mit Di Xiao oder Fengxia Meng.

Diese Studie wurde vom Ethical Review Committee des Institute for Infectious Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention (Nr. ICDC-202304) unterstützt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die Routinesequenzierung wurde verwendet, um VGSC-Gene in 70 wild gesammelten Proben nachzuweisen.

Zur Etablierung der MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie wurden insgesamt 13 Proben verwendet. MS-Peaks der MPE-Sonden.

Die Nachweisergebnisse von 70 Proben mithilfe der MPCR-MS-Minisequenzierungstechnologie.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mu, Q., Zhao, X., Li, F. et al. Eine neuartige Strategie zum Screening von Mutationen im spannungsgesteuerten Natriumkanal-Gen von Aedes albopictus basierend auf der Multiplex-PCR-Massenspektrometrie-Minisequenzierungstechnologie. Infect Dis Poverty 12, 74 (2023). https://doi.org/10.1186/s40249-023-01122-y

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Eingegangen: 17. April 2023

Angenommen: 20. Juli 2023

Veröffentlicht: 15. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s40249-023-01122-y

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